Untersuchungen zur regulierbaren transgenen Expression von Ribozymen und „Antisense"-Transkripten mit dem Ziel einer Reduktion der Prm3-Expression

Abstract

Die spezifische Ausschaltung von Genen ("Knockout") ist eine wichtige Methode zur Untersuchung der Genfunktion. Die klassische und am häufigsten benutzte Methode basiert auf dem Mechanismus der homologen Rekombination und führt über die Rekombination von Teilen eines sog. "Knockout"-Konstruktes mit homologen Bereichen des Zielgens zu dessen Unterbrechung. Für viele Anwendungen ist es jedoch vorteilhaft, den genomischen Locus nicht irreversibel zu verändern. Daher werden zunehmend alternative Strategien entwickelt. Prinzipiell sind Eingriffe auf allen Ebenen des genetischen Informationsflusses denkbar. Allgemein lassen sich drei Typen von Strategien unterscheiden: Anti-Gen-, Anti-RNA- und Anti-Protein-Strategien. Die dieser Arbeit zugrundeliegende Idee war ein konditionaler Eingriff in die Genexpression der Maus. Durch die Kombination verschiedener "Antisense"-Techniken mit dem induzierbaren Genexpressionssystems (Tet-On) sollten mRNA-Effektormoleküle (Antisense, Ribozyme o.ä.) unter der Kontrolle eines aktivierbaren Transkriptionsfaktors exprimiert werden und die Unterbrechung des genetischen Informationsflusses auf RNA-Ebene ermöglichen. Die Expression dieser Effektormoleküle war spezifisch gegen die mRNA verschiedener Gene des evolutionär konservierten Genclusters der Protamine gerichtet. Vor allem die Anwendung der katalytisch aktiven Effektormoleküle (Ribozyme) auf eine mRNA wird erheblich von deren Sekundärstrukturen beeinflußt. Die Aktivität von spezifischen Ribozymen wurde deshalb zunächst in vitro getestet, bevor sie als Effektormoleküle über das induzierbare Expressionssystem in Zellkulturen und in Mäusen eingesetzt wurden. Die tetracyclinabhängigen Genexpressionsysteme werden zudem selbst durch verschiedenste Faktoren beeinflußt und unterliegen deshalb noch ständiger Forschung. Für das hier verwendete Tet-On-System wird in dieser Arbeit eine Veränderung vorgestellt, die zu deutlich verbesserten Aktivierungseigenschaften führt.