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Congenital Disorder of Glycosylation (CDG)-IIc: Eine retrovirale Expressionsklonierung identifiziert das CDG-IIc Syndrom (Leukozyten Adhäsionsdefekt II) als eine GDP-Fukose Transporter Defizienz

dc.contributor.advisorKörner, Christian PD Dr.de
dc.contributor.authorLübke, Torbende
dc.date.accessioned2012-04-16T14:46:11Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:46Zde
dc.date.issued2001-07-23de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-ABCF-Cde
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-69
dc.description.abstractBei der N-Glykosylierung handelt es sich um die häufigste Modifikation sezernierter und Membran-gebundener Proteine in eukaryontischen Zellen. Biomedizinische Relevanz erlangte die N-Glykosylierung in den letzten Jahren auch dadurch in erhöhtem Maß, dass einige angeborene Erkrankungen beim Menschen charakterisiert werden konnten, bei denen die genetischen Defekte zu Veränderungen in der Bildung der N-Glykane führen. Der gesamte Vorgang der N-Glykan Synthese umfasst etwa 100 Enzyme und Transporterproteine. Diese Komplexität lässt vermuten, dass eine Vielzahl genetischer Defekte zu Störungen der Glykoprotein-Synthese führen können. In den letzten 20 Jahren konnten sieben Defekte (Stand 01/2001) der N-Glykan Synthese biochemisch und molekulargenetisch identifiziert werden und wurden unter der Bezeichnung "Congenital Disorders of Glykosylation (CDG)" als eine Krankheitsgruppe klassifiziert. In der vorliegenden Arbeit konnte ein weiteres Syndrom biochemisch und molekulargenetisch identifiziert werden (CDG-IIc). Bei einem Patienten, der die typischen klinischen Merkmale des "Leukozyten Adhäsionsdefekts II (LAD II)" wie schwere Entwicklungsstörungen, vermindertes Wachstum und eine schwere Immunschwäche aufwies, konnte eine generelle Hypofucosylierung der Glykoproteine festgestellt werden. Die generelle Hypofucosylierung der Glykokonjugate in Patientenzellen konnte auf einen verminderten Import von GDP-Fucose in den Golgi zurückgeführt werden. Da das Gen für den GDP-Fucose Transporter noch in keiner Spezies bekannt war und zudem nicht ausgeschlossen werden konnte, dass die Transportdefizienz einen Defekt eines Transport-assoziierten Kofaktors darstellt, wurde eine Expressionsklonierung mit einer retroviralen cDNA-Bank in den Fibroblasten des Patienten durchgeführt. Kontrollfibroblasten und komplementierte Patientenfibroblasten konnten durch die Markierung mit dem Fucose-spezifischen Aleuria aurantia Lektin von nicht-komplementierten Patientenfibroblasten unterschieden werden. Nach vier Komplementationsrunden, in denen cDNA-Pools sukzessive verkleinert wurden, konnte die komplementierende D5-cDNA isoliert werden. Die Aminosäuresequenz der D5-cDNA wies signifikante topologische Übereinstimmungen mit bekannten Zuckernukleotid Transportern auf. Die retrovirale Expression der D5-cDNA normalisierte in Patientenfibroblasten die GDP-Fucose Transport Aktivität und den Fucosylierungsstatus. Bei der molekulargenetischen Analyse von drei Patienten wurden zwei jeweils homozygot vorliegende Punktmutationen detektiert, die zu Aminosäure Austauschen in unter allen Orthologen stark konservierten Transmembrandomänen führen. Diese Befunde belegen, dass dem CDG-IIc (LAD II) Syndrom ein Defekt im GDP-Fucose Transportergen zugrunde liegt.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isogerde
dc.rights.urihttp://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyrdiss.htmde
dc.titleCongenital Disorder of Glycosylation (CDG)-IIc: Eine retrovirale Expressionsklonierung identifiziert das CDG-IIc Syndrom (Leukozyten Adhäsionsdefekt II) als eine GDP-Fukose Transporter Defizienzde
dc.typedoctoralThesisde
dc.contributor.refereeFigura, Kurt von Prof. Dr. Dr. h.c.de
dc.date.examination2001-04-26de
dc.subject.dnb570 Biowissenschaften, Biologiede
dc.description.abstractengN-glycosylation is the most common modification of secretory and membrane-bound proteins in eukaryotic cells. In the last few years N-glycosylation obtained increased biomedical relevance by the fact that several inherited disorders were characterised in human affecting the biosynthesis of N-glycans. The whole process of N-glycosylation comprises more than 100 enzymes and transport proteins. Thus nearly 3% of the human genome codes for genes involved in this pathway. This complexity presumes that several genetic defects associate with deficiencies in this pathway. During the last 20 years the molecular cause of seven defects (01/2001) were identified and subsequently classified as "Congenital Disorders of Glycosylation (CDG)". In the submitted work the biochemical and genetic cause of an eighth syndrome in the CDG group, CDG-IIc, could be identified. A patient presenting the typical clinical stigmata of Leukocyte Deficiency type II (LAD II) showed a general hypofucosylation of glycoproteins due to a decreased import of GDP-fucose into the Golgi. Since the gene of the GDP-fucose transporter wasn't cloned in any species so far and it couldn't be excluded that the transport deficiency was due to a defect of a transport-associated co-factor, an expression cloning strategy using a retroviral cDNA library in the fibroblasts of the patients was chosen. Fibroblasts of control persons and complemented fibroblasts of the patient could be labelled with the fucose-specific Aleuria aurantia lectin while non-complemented fibroblasts of the patients couldn't. After performing four rounds of complementation with subsequently reduced cDNA pools a single cDNA capable of complementing the hypofucosylated phenotype of the patient was isolated. Topologically the predicted protein showed significant similarities to other known nucleotide sugar transporters. A retroviral expression of the isolated cDNA normalised or even elevated the amount of imported GDP-fucose into the fibroblasts of the patient and the state of fucosylation of the glycoproteins. The molecular analysis of three patients revealed homozygous point mutations leading to amino acid exchange in transmembrane domains conserved in all orthologues. These results indicate that the defect responsible for CDG-IIc (LAD II) is due to a defect in the GDP-fucose transporter.de
dc.contributor.coRefereeGottschalk, Gerhard Prof. Dr.de
dc.subject.topicMathematics and Computer Sciencede
dc.subject.gerGlykosylierungde
dc.subject.gerCDGde
dc.subject.gerGDP-Fukose Transporterde
dc.subject.gerretrovirale Expressionsklonierungde
dc.subject.engGlycosylationde
dc.subject.engCongenital Disorder of Glycosylationde
dc.subject.engGDP-Fucose Transporterde
dc.subject.bk42.13de
dc.subject.bk42.15de
dc.subject.bk42.20de
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1037-5de
dc.identifier.purlwebdoc-1037de
dc.affiliation.instituteBiologische Fakultät inkl. Psychologiede
dc.subject.gokfullWAde
dc.subject.gokfullWHde
dc.subject.gokfullWDde
dc.identifier.ppn334024544


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