Untersuchung von Proteinkomponenten der ER-Golgi Recycling-Maschinerie von Hefe

Abstract

In Hefe werden alle bisher untersuchten ER-Proteine, die zum Golgi gelangen, mit Hilfe von COPI-Vesikeln zum ER zurücktransportiert. Bisher ist aber noch ungeklärt, wie die unterschiedlichen Proteine in die Vesikel dirigiert werden.Durch Verwendung eines Sec22-a-Hybridproteins konnte in unserer Arbeitsgruppe gezeigt werden, daß auch Sec22p, ein überwiegend im ER lokalisiertes v-SNARE des frühen sekretorischen Transportwegs, mit Hilfe von COPI-Vesikeln zum ER zurückgelangt (Ballensiefen et al.; 1998). Es enthält jedoch keines der bisher bekannten Rückführungssignale (HDEL- bzw. KKXX-Sequenz). Ziel dieser Arbeit war es daher, Proteinkomponenten zu isolieren, die entweder am Recyclingprozeß des Sec22p beteiligt sind oder direkt mit Sec22p interagieren.Im ersten Teil dieser Arbeit wurde systematisch nach Genen gesucht, die bei Überexpression die vorherrschende ER-Lokalisation von Sec22p und anderen integralen Membranproteinen, die ein KKXX-Motiv tragen, stören. Da aus der Literatur bekannt ist, daß zelluläre Transportprozesse durch Überproduktion bestimmter Proteine, die selbst im vesikulären Transport involviert sind, gehemmt werden können lag es nahe, daß es sich dabei um Komponenten einer spezifischen Recyclingmaschinerie handeln könnte. Stellvertretend für die Sec22p-Lokalisation wurde das Verhalten des Sec22-a Reporters untersucht, der sich wie Sec22p hauptsächlich im ER aufhält. Ein gestörter Recyclingmechanismus äußert sich in einer meßbaren Fehllokalisation des Sec22-a Reporters in den späten Golgi. Eine durch das KKXX-Motiv vermittelte ER-Retention wurde mit Hilfe des Ste2-Wbp1p Reporters analysiert, der bei gestörter Rückführung zum ER zur Plasmamembran fehllokalisiert wird. Mit Hilfe von multi-copy"-Plasmiden wurde ein Gen isoliert, dessen Genprodukt bei Überproduktion den Recyclingmechanismus beider Reporter beeinflußt: Sed5p. Es handelt sich hierbei um ein für die Hefe essentielles t-SNARE, das im frühen Golgi lokalisiert ist. Aus früheren Untersuchungen (Hardwick et al., 1992) ist bekannt, daß lösliche Frachtmoleküle wie die Carboxypeptidase Y (CPY) und die Alkalische Phosphatase (ALP) unter diesen Bedingungen eine verlangsamte Kinetik des ER-Golgi Transports aufweisen. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführte eingehende Analyse der durch SED5-Überexpression hervorgerufenen Defekte wies auf Unterschiede im Transportverhalten zwischen löslichen und membranständigen Proteinen hin. Bei den untersuchten membranständigen Reportern Sec22-a bzw. Ste2-Wbp1p wurde der entgegengesetzte Effekt beobachtet: Sie wurden schneller transportiert. Dieser forcierte Transport der membranständigen Proteine konnte durch die Überproduktion von Sfb2p aufgehoben werden, während die verlangsamte Kinetik der lösliche Proteine (CPY und ALP) nicht beeinflußt wurde. Da Sfb2p eine Untereinheit eines neuartigen Hüllproteinkomplexes von am ER generierten Vesikeln ist, liegt die Vermutung nahe, daß in den Vesikeln, an deren Generierung Sfb2p beteiligt ist, spezielle Frachtmoleküle transportiert werden, die für eine effiziente Sortierung der eingesetzten Sec22-a bzw. Ste2-Wbp1p Reporter in Vesikel des retrograden Golgi-ER Transports sorgen. Die in einem SFB2-Deletionsstamm auftretende vermehrte Fehllokalisation sowohl des Sec22-a Reporters als auch von GFP-Sec22p in den Golgi unterstützt diese Vermutung. Somit konnte mit der vorliegenden Arbeit das Ziel erreicht werden, ein Protein zu finden, das spezifisch das Recyclingverhalten von Sec22p und Ste2-Wbp1p beeinflußt.Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde das Zwei-Hybrid-System verwendet, um neue Interaktionspartnern von Sec22p zu identifizieren. Es konnte mit der zytoplasmatischen Domäne von Sec22p als Köder aus einer c-DNA-Genbank ein Klon isoliert werden, der für die C-terminale Domäne der Acetyl-CoA-Carboxylase (Acc1p) in Hefe kodiert. Acc1p synthetisiert Malonyl-CoA, eine Ausgangssubstanz für die zytosolische Fettsäurebiosynthese sowie für die Fettsäurekettenverlängerung durch Elongasen am ER. Die Interaktion zwischen Acc1p und Sec22p konnte sowohl mit GST- pull-down"-Experimenten in vitro als auch durch Kreuzungen von Mutantenstämmen genetisch bestätigt werden. Untersuchungen weiterer SNAREs ergaben, daß auch Ufe1p und Sed5p sowohl im Zwei-Hybrid-System als auch GST- pull-down"-Experimenten an Acc1p binden. Die Tatsache, daß Acc1p teilweise am ER lokalisiert ist, läßt die Vermutung zu, daß die SNAREs, möglicherweise sogar als oligomerer Komplex, diese ER-Assoziation vermitteln. Dabei scheint das Vorhandensein eines Wildtyp-Sec22p entscheident für die Acc1p-Lokalisation am ER zu sein. Da Acc1p bei blockiertem ER-Golgi Transport hauptsächlich in zytosolischer Form vorliegt, läßt sich ein Zusammenhang zwischen vesikulärem Transport und Acc1p-Lokalisation herstellen. Es konnte gezeigt werden, daß Palmitoyl-CoA, eine Ausgangssubstanz der Fettsäurekettenverlängerung, die Bindung von Acc1p an die SNARE-Proteine Sec22p und Ufe1p verstärken kann. Diese Umverteilung von Acc1p vom Zytosol an das ER könnte somit eine wichtige regulative Funktion bei der Synthese längerkettiger Fettsäuren darstellen, was eventuell die Sphingolipid- und Ceramid-Synthese beeinflußt.