Mechanismus der Hemmung der glucagon-stimulierten Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-1-Genexpression durch das proinflammatorische Interleukin 6 in primär kultivierten Rattenhepatozyten

Abstract

Im Verlauf einer Sepsis führt Dysregulation der vor allem durch Glucagon stimulierten hepatischen Glucose-Freisetzung zur Hypoglykämie. Interleukin-6 (IL6) ist der Hauptmediator der hepatischen Akut-Phase-Reaktion. In kultivierten Rattenhepatozyten hemmte IL6 die durch Glucagon ausgelöste Steigerung der Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-1-(PCK1)- Genexpression und den die Steigerung vermittelnden cAMP-Anstieg. Ziel dieser Arbeit war es, den molekularen Mechanismus der Hemmung der Glucagonwirkung auf das PCK1-Gen durch IL6 zu charakterisieren, wobei zur Kontrolle der wie Glucagon über cAMP wirkende ß-Agonist Isoproterenol eingesetzt werden sollte. In primär kultivierten Rattenhepatozyten stimulierten Glucagon und Isoproterenol den Anstieg der PCK1-mRNA. IL6 hemmte sowohl den durch Glucagon als auch den durch Isoproterenol stimulierten PCK1-mRNA-Anstieg. Glucagon und Isoproterenol steigerten in kultivierten Rattenhepatozyten die cAMP-Bildung, aber nur die glucagon-stimulierte cAMP-Bildung wurde durch IL6 gehemmt. Infolge intrazellulär erhöhter cAMP-Spiegel wurde die Glucose-Freisetzung aus Glykogen durch Glucagon und Isoproterenol in kultivierten Rattenhepatozyten stimuliert. IL6 hemmte die glucagon-stimulierte, aber nicht die isoproterenol-stimulierte Glucose-Freisetzung. Zunächst sollte nun geklärt werden, warum IL6 nur den glucagon-, nicht aber den isoproterenol-abhängigen cAMP-Anstieg inhibierte. Hier schien ein Angriffspunkt am Glucagon-Rezeptor wahrscheinlich. Daher wurde ein Glucagon-Rezeptor-Bindungsassay mit Membranen aus kultivierten Rattenhepatozyten etabliert. IL6 verminderte die 125J-Glucagon-Bindung transient. Die Verminderung der verfügbaren Glucagon-Rezeptoren könnte die Hemmung des glucagon-abhängigen cAMP-Anstiegs durch IL6 erklären. Weiterhin reduzierte IL6 in Membranen aus kultivierten Rattenhepatozyten die KD der Bindungsstelle für Glucagon; es erhöhte also die Affinität des Glucagons zum Rezeptor. Dies könnte auch zur Inhibition des Glucagon-abhängigen cAMP-Anstiegs durch IL6 beitragen, da bei einigen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren die Affinitätserhöhung zum Liganden mit einer Hemmung der cAMP-Bildung, vermutlich über eine Erschwerung der Dissoziation des Gs-Proteins, einhergeht. Da der gemeinsame Angriffspunkt bei der Hemmung der glucagon- und isoproterenol-abhängigen PCK1-Genaktivierung durch IL6 nicht die cAMP-Bildung war, kam ein in der Signalkette weiter distal gelegener Schritt, z.B. ein Antagonismus im PCK1-Promotor gegen cAMP-stimulierte Transkriptionsfaktoren, die das Gen aktivieren, in Betracht. Diese Möglichkeit wurde in primären Rattenhepatozyten-Kulturen, die mit PCK1-Promotor-Luciferase-Genkonstrukten transfiziert wurden, untersucht: Insgesamt zeigen die Transfektionsexperimente, daß es zwar Angriffspunkte für eine positive und negative Regulation des PCK1-Genexpression durch IL6 im Bereich des PCK1-Promotors bis 1149 bp gibt, daß aber der Angriffspunkt für den IL6-Glucagon-Antagonismus außerhalb des untersuchten Promotorbereichs bis 2500 bp lokalisiert sein muß.