Guanylatkinase: Von einem aktiven Enzym zu einem inaktiven Multidomänen-Protein.
von Oliver Spangenberg
Datum der mündl. Prüfung:2001-05-02
Erschienen:2001-06-14
Betreuer:Dr. Manfred Konrad
Gutachter:Prof. Dr. Gerhard Braus
Gutachter:Prof. Dr. Dieter Gallwitz
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Size:21.0Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
Guanylate kinase (GUK) is an essential enzyme for nucleotide metabolism and catalyses the reversible transfer of the terminal phosphoryl group from Mg×(d)ATP to (d)GMP. Although the catalytic mechanism of the guanylate kinase is known, functional and structural data of the ezyme in comparison to other nucleoside monophosphate kinases are rare. In this work we analysed the guanylate kinases of several species. In contrast to Saccharomyces cerevisiae, mouse and human guanylate kinases that have similar catalytic efficiencies, the Arabidopsis thaliana guanylate kinase AGUK1 shows considerable structural and kinetic deviations. Unlike the guanylate kinases from other sources, AGUK1 carries N- and C-terminal extensions of unknown functions surrounding the central guanylate kinase domain. The purified recombinant full length AGUK1 and the guanylate kinase domain are 100-fold less active than the yeast enzyme. N- and C-terminal deletions appear to have no regulatory effect on enzyme catalysis. Because of structural similarities the plant enzyme may represent an evolutionary link between the small guanylate kinases and the larger membrane-associated guanylate kinases (MAGUKs). MAGUKs are modular cytoskeletal proteins composed of one to three PDZ domains, an SH3 domain and a C-terminal GK domain with 33-37% identity to guanylate kinases from mammals. When purified from E. coli the GK domains of the MAGUK proteins SAP97 and hCASK showed no measurable guanylate kinase activity and were not able to complement the recessive lethal phenotype of a GUK1-deficient yeast strain. The GK domain appears to have evolved a structural role in assembly of macromolecular complexes. This view is supported by the recent finding of a new family of proteins (GKAP and SAPAPs) that specifically interact with this domain. Using nano electrospray mass spectrometry as a tool for direct observation of protein-ligand interactions several purine nucleotides were identified as ligands of SAP97-GK. Of all purine nucleotides tested, GMP showed the highest affinity to the GK domain. By means of analytical ultracentrifugation a specific interaction between the SH3 domain and the GK domain of SAP97 was identified. This intramolecular interaction dominates in monomeric SAP97-SH3/GK construct and is mediated by at least two interaction sites. On the basis of our preliminary results we established a model for the regulation of the intramolecular interaction in SAP97. According to this GMP has the role of an effector molecule, that together with ligands of the SH3 domain modulates the intramolecular interaction in SAP97-SH3/GK. This intramolecular regulation might influence the binding of the GK domain with its binding partners in trans.Weitere Sprachen
Die Guanylatkinase ist ein essentielles Enzym des Purinnukleotid-Stoffwechsels und katalysiert die reversible Übertragung der terminalen Phosphatgruppe von Mg×(d)ATP zu (d)GMP. Obwohl der katalytische Mechanismus der Guanylatkinase weitestgehend aufgeklärt ist, sind Daten zur Funktion und Struktur des Enzyms im Vergleich zu anderen Nukleosidmonophosphatkinasen bisher rar. In dieser Arbeit wurden die Guanylatkinasen von Saccharomyces cerevisiae, zwei Säugern und die erste einer Pflanze biochemisch und kinetisch untersucht. Während die katalytische Effizienz der Guanylatkinase des Menschen und der Maus ähnlich jener der Hefe ist, weicht die A. thaliana-Guanylatkinase AGUK1 sowohl strukturell, als auch kinetisch beträchtlich von den bisher bekannten Guanylatkinasen ab. Neben der zentralen Guanylatkinase-Domäne, welche 100fach weniger aktiv als das Hefe-Enzym ist, besitzt sie N- und C-terminale Verlängerungen, deren Funktionen bisher nicht bekannt sind. Der strukturelle Aufbau aus mehreren Domänen und die Sequenz-Ähnlichkeit des N-Terminus deuten auf eine Verwandtschaft zu den größeren Membran-assoziierten Guanylatkinasen (MAGUKs) hin. MAGUKs wurden als Gerüstproteine an neuronalen und epithelialen Kontaktstellen von Vertebraten identifiziert. Sie besitzen eine Multidomänenstruktur und sind aus einer bis drei PDZ, einer SH3 und einer C-terminalen GK-Domäne mit 33-37%iger Sequenz-Identität zu Säuger-Guanylatkinasen aufgebaut. Die GK-Domänen der MAGUK-Proteine SAP97 und hCASK zeigten nach Aufreinigung aus E. coli keine meßbare Guanylatkinase-Aktivität und konnten den rezessiv letalen Phänotyp eines GUK1-defizienten Hefestammes nicht komplementieren. Vieles deutet daraufhin, daß die GK-Domäne in MAGUK-Proteinen nur noch eine strukturelle Funktion als Protein-Bindungsdomäne besitzt. Mit der Methode der Nano-Elektrospray-Massenspektrometrie wurden mehrere Purinnukleotide als Liganden der GK-Domäne von SAP97 identifiziert. Unter allen getesteten Purinnukleotiden zeigte GMP die höchste Affinität zur GK-Domäne. Darüberhinaus wurde mit der Methode der analytischen Ultrazentrifugation eine intramolekulare Interaktion zwischen der SH3- und der GK-Domäne von SAP97 nachgewiesen, welche im monomeren SAP97-SH3/GK-Konstrukt dominiert und über mindestens zwei Interaktionsstellen verläuft. Auf Basis der vorliegenden Ergebnisse wurde ein Modell zur hypothetischen Regulation der intramolekularen Interaktion in MAGUK-Proteinen entwickelt. Nach diesem besitzt GMP die Funktion eines Effektormoleküls, welches im Zusammenspiel mit Liganden der SH3-Domäne die intramolekulare Interaktion in SAP97-SH3/GK moduliert. Sollte sich dieser Regulationsmechanismus tatsächlich bestätigen, so eröffnet er neue Einblicke in den molekularen Mechanismus, welcher der Funktion von MAGUK-Proteinen bei der Zusammenlagerung von Multiprotein-Komplexen zugrundeliegt.
Schlagwörter: Guanylatkinase; Purinnukleotide; Nukleotid-Bindung; Saccharomyces cerevisiae; Multidomänen-Proteine; Intramolekulare Interaktion; Elektrospray-Massenspektrometrie; Analytische Ultrazentrifugation