The susceptibility of primordial germ cells to malignant transformation and isolation and characterization of members of a new gene family differentially expressed in invasive and non-invasive immortalized male germ cells

Abstract

In dieser Arbeit untersuchten wir die Potenz der Primordial Keimzellen (PGCs) zur malignen Transformation unter Verwendung eines transgenen Mausmodell. In diesem Modell verwendeten wir das SV40 large Tumor Antigen (LTA),welcher mit dem Keimzellen alkalische Phosphatase (GCAP) Promotor verbunden ist, um direkt die Onkogenische Aktivität von SV40-LTA hinsichtlich PGCs spezifischally zu richten. Menschliche GCAP sich entwicklungsmässig in Primordial Keimzellen und auch in der Entwicklungsphasen vom Zweizellenstadium bis zum Blastozyststadium der Präimplantationsentwicklung ausgedrückt ist, und wieder erscheint in Spurbeträgen in der Erwachsenen Hoden. Weiterhin kommt GCAP im Vorkrebsstadium der Testikular Keimzellen Tumoren vor (carcinoma in situ),und auch in höhen differenzierten Tumoren vor. Wir analysierten die regulierende Sequenz der 5´flankierende Region des menschlichen GCAP Gens,welches Verantwortlich für seine Expression in verschiedenen Testikular Keimzellen Tumoren Verantwortlich ist,um zu beweisen,dass die minimale Promotorregion genügt für eine hohe und gewebespezifische Expression des GCAP. Drei unabhängige transgenetische Linien wurden erzeugt unter Benutzung eines 1.7 kb Fragment 5´flankierende des GCAP Gens als Promotor. Die RT-PCR Analyse zeigte die testisspezifische Expression von LTA in dem erwachsenen heterozygoten und homozygoten transgenetischen Mäusen in geringen Mengen. Weiterhin konnten wir LTA mRNA in 8.5 dpc pränatalen transgenetischen Embryonen entdecken. Wie auch immer,nach einer Periode von 20 Monaten,wurde kein Tumor in einem Organ dieser Mäuse entdeckt. Die Verwendung eines "in vitro" Verfahrens der Analysierung unterschiedlich ausgebildeter Gene in GC-1spg Zellen durch Suppression subtraktiver Hybridizierung (SSH),ein relativ unbekanntes Gen,welches hochentwickelt war in invasiven GC-1spg Zellen identifiziert wurden. Wir bezeichneten dieses Gen Pfcp (PHD-finger ähnlich chromatin proteins) weil die deduzierte Proteinsequenz eine Domäne zeigt,welche bekannt als PHD-finger ähnliche Domäne ist,dafür bekannt ist in die chromatin Bindung integriert zu sein. Die cDNA Sequenz des Pfcp Gens der Maus wurde isoliert und analysiert,wie auch ihre genomische Struktur isoliert und analysiert wurde. Das Expression muster des Maus Pfcp und seine Zellulare und Subzellulare Position wurde bestimmt: Überprüfung einer Mäusecosmidbibliothek und einer genomischen southern blot zeigte das Muster einer Genfamilie welche aus ca.vier verschiedenen murine Pfcp Genen besteht. Northern blot Analysen zeigte ein Transkript von ungefähr 1.2 kb. Die Expression von Pfcp in den unterschiedlichen Mäusegeweben ist überall vorhanden. Die Expressionsanalyse des menschlichen PFCP zeigte auch einen überall vorhandenen Expression. Pfcp wird im Zellkern lokalisiert und bindet an chromatinstrukturen im Interphase und im Metaphase der Zellzyklus.