Characterisation of Vti1b and Vti1a proteins and generation of knock-out mice.

Abstract

Genomische DNA Fragmente für Vti1b und Vti1a wurden isoliert und die chromosomale Bereiche charakterisiert. Durch gezielte Ausschaltung der Gene wurden Mausmutanten erzeugt. Es wurde gezeigt, dass Vti1b kein essentielles Protein ist. Durch die Abwesenheit von Vti1b hat sich die Menge an Syntaxin 8 in allen Zellen und Geweben reduziert, während die Menge an Syntaxin 8 mRNA unverändert blieb. Die Vti1b defizienten Tiere zeigen einen heterogenen Phänotyp in Form von normal großen und kleinen Mäusen. Die normal großen Vti1b-knockout Mäuse haben keine nachweisbaren Defekte im Transport zum Lysosom, aber die Hepatozyten der kleinen Vti1b knockout Mäusen zeigen eine Verlangsamung im Proteintransport von späten Endosomen zu Lysosomen, erkennbar z.B. durch verlangsamten Abbau von EGF-Rezeptor und Asialofetuin, und reduzierte Reifung von Cathepsin D. Die elektronenmikroskopischen Daten haben gezeigt dass multivesikuläre späte Endosomen und Autophagosomen in den Hepatozyten der kleinen Vti1b-defizienten Mäuse angereichert waren. Häufig waren die Autophagosomen in engem Kontakt angeordnet und waren im Vorgang der Fusion begriffen, wie es in Hepatozyten der Wildtyp- und der nomal großen Vti1b-defizienten Mäuse nicht beobachtet wurde. Im Vergleich zu Vti1b war der chromosomale Bereich für Vti1a wenigstens dreimal so groß. Es wurden zwei Targeting DNA Konstrukte mit Hilfe von zwei unterschiedlichen Knockout Strategien hergestellt. Zwei embryonale Stammzellklone, die eine mutierte Kopie von Vti1a tragen, sind selektiert und verwendet worden, um chimäre Mäuse zu erhalten.