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Functional Characterization of Neurexophilins in the Central Nervous system

dc.contributor.advisorRichter, Diethelm Prof. Dr.de
dc.contributor.authorBenglopoulos, Vasileiosde
dc.date.accessioned2012-04-16T14:46:32Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:27Zde
dc.date.issued2002-09-04de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-ABEA-Ede
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-96
dc.description.abstractIn der vorliegenden Arbeit wurde die Lokalisation und Funktion von Neurexophilinen mittels eines neurogenetischen Ansatzes im Gehirn von Mäusen untersucht. Neurexophiline (Nphs) konstituieren eine Proteinfamilie von Glykoproteinen, die ursprünglich als eine Komponente der alpha-Neurexine isoliert wurde, dem ersten klonierten alpha-Latrotoxinrezeptor (Petrenko et al., 1993). Vorausgehende Studien haben gezeigt, dass Nphs sezernierte Proteine mit einem relativ geringen Molekulargewicht darstellen (ca. 19 kDa deglykosyliert), und deren Eigenschaften in mancherlei Hinsicht denen von Neuropeptiden ähneln (Petrenko et al., 1996, Missler and Südhof, 1998, Missler et al, 1998). Die hier vorgestellte Arbeit steht vor dem Hintergrund der Frage, ob die Nphs eine putative Signalfunktion über ihre Interaktion mit alpha-Neurexinen ausüben, und dadurch möglicherweise die Effizienz der synaptischen Transmission beeinflussen können. Zur Beantwortung dieser weitreichenden Hypothese sollten im Rahmen dieser Doktorarbeit die entsprechenden Werkzeuge generiert werden, um eine solche Funktion experimentell überprüfen zu können. Im einzelnen wurden 4 Teilprojekte durchgeführt: (i) Nph3 knock-in Maus mittels Cre/loxP Technik (Nph3-KI). Im ersten Schritt wurde hier zunächst das Nph3 Gen kloniert und seine Intron-Exon-Struktur charakterisiert. Darauf aufbauend wurde ein Nph3 knock-in Vektor konzipiert und kloniert, der zum einen das Protein als Fusionsprotein mit C-terminalem Flagepitope enthielt und zum anderen über eine bicistronische Eintrittsstelle diejenigen Zellen durch beta-Galaktosidaseaktivität markieren sollte, welche das Protein sezernieren. (ii) Nph3 knock-out Maus (Nph3-KO). Bei der Konstruktion des Targetingvektors wurden die notwendigen DNS Abschnitte mit loxP Erkennungssequenzen flankiert, um im zweiten Schritt die Konvertierung des KI in einen kompletten knockout zu erlauben. Dies wurde durch Einkreuzen eines transgenen Mausstammes erreicht, der die Cre Rekombinase unter einem ubiquitär exprimierten Promoter (adenovirale EIIa Region) enthält. (iii) Nph1 und Nph3 Doppelknockout Maus (Nph1/Nph3-KO). Nach Etablierung der homozygoten Nph3-KO Linie wurde der Doppelknockout durch Einkreuzen mit einem bereits existierenden Nph1-KO (Missler et al., 1998) hergestellt. Parallel zu diesen neurogenetischen Ansätzen wurde (iv) die Expression von rekombinantem Nphs optimiert, um neue Antikörper gewinnen und in vitro Experimente z.B. auf primären hippokampalen Neuronen durchführen zu können.Der erste wichtige Befund der vorliegenden Arbeit besteht in einer exakten Bestimmung und Charakterisierung der neuronalen Zellpopulationen, die Nph3 exprimieren. Durch vergleichende in-situ-Hybridisierungsdaten war zu vermuten, dass Nph3 nur sehr lokalisiert vorkommt. Die hier verwendete Methode, solche Zellen im Rahmen eines knock-ins durch einen hoch-sensitiven beta-Galaktosidase Assay anzufärben, demonstrierte ein interessantes Verteilungsmuster: Während der Ontogenese und persistierend ins adulte Alter exprimieren v.a. Zellen in der Lamina VIc der Grosshirnrinde das Nph3. Während der Entwicklung kommt es zur Markierung transienter Zellpopulationen, z.B. der Cajal-Retzius Zellen in der Marginalzone und den hippokampalen Cajal-Retzius Zellen im Gyrus Dentatus. Stark angefärbt werden ausserdem transient die Körnerzellen der Lobulae 9 und 10 des Vermis Cerebelli. In embryonalen Präparaten konnte ausserdem Nph3 Expression in der Riechschleimhaut und dem Vomeronasalorgan nachgewiesen werden. Auch wenn die genannten neuronalen Populationen sich nicht einfach unter eine gemeinsame Kategorie einordnen lassen, so zeigt sich doch eine Tendenz für Nph3, ontogenetisch alte Neurone zu markieren, die häufig mit Regionalisierungsfunktionen von synaptischen Terminationsgebieten in Verbindung gebracht wurden.Der zweite wichtige Befund ist, dass der Doppelknockout der beiden an alpha-Neurexin bindenden Nph Isoformen (Nph1 und Nph3) nicht den knockout der alpha-Neurexine imitiert, da der Nph1/Nph3-KO lebensfähig ist und keine auffälligen morphologischen Veränderungen der Hirnanatomie zeigt. Genauere Analysen der knockouts mittels verhaltensbiologischer und elektrophysiologischer Experimente sollen nun Aufschluss über die tatsächliche Funktion der Nphs geben.Die oben genannten Befunde einschliesslich einer extensiven vergleichenden Analyse der z.Zt. verfügbaren Genomdatenbanken lassen die Vermutung zu, dass die Nphs entgegen ihres Entdeckungskontextes als strukturelle Komponente der alpha-Neurexine nicht essentiell für die Funktion der alpha-Neurexine sind, sondern eher eine modulatorische Funktion ausüben. Bei der Analyse einer solch putativen Signalfunktion werden die in dieser Doktorarbeit generierten transgenen Mauslinien und die entwickelte Strategie zur Expression von rekombinantem Nphs eine herausragende Rolle spielen.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyrdiss.htmde
dc.titleFunctional Characterization of Neurexophilins in the Central Nervous systemde
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedFunktionelle Charakterisierung von Neurexophilinen im Zentralnervensystemde
dc.contributor.refereeSchürmann, Friedrich-Wilhelm Prof. Dr.de
dc.date.examination2002-06-20de
dc.subject.dnb570 Biowissenschaften, Biologiede
dc.description.abstractengNeurexophilins (Nphs) form a family of proteins that were discovered as components of the alpha-latrotoxin receptor, based on their strong binding to the synaptic membrane proteins alpha-neurexins (Petrenko et al., 1993). Previous studies have shown that neurexophilins are secreted proteins of small molecular weight with structural features that resemble those of neuropeptides, suggesting a possible signaling function mediated by alpha-neurexins (Petrenko et al., 1996, Missler and Südhof, 1998, Missler et al., 1998). The current study aimed to investigate further the hypothesis of a signaling function of neurexophilins in the central nervous system and to provide the tools for uncovering this potential function. Taken into account former studies on Nph1, a neurogenetic approach was followed by the use of the knock-in technology in order to characterize in vivo the role of Nph3 in the mouse brain. This involved the generation of three transgenic mouse lines, namely a Nph3-KI, a Nph3-KO and a double Nph1/Nph3-KO mouse line. As a first step, the Nph3 gene was cloned and its exon-intron structure was mapped. A Nph3-KI targeting vector was designed in a way to result in the generation of a bicistron ic mRNA, encoding for a fusion Nph3-Flag protein, as well as for beta-galactosidase fused to a nuclear localization signal. The targeting vector was cloned and its function was tested successfully in COS7 cells by Flag immunocytochemistry and beta-galactosidase staining. The targeting vector was inserted into ES cells in culture and a Nph3-KI mouse line was generated (blastocyst injections and transplantations were performed in collaboration). By the use of the Cre-loxP systrem, based on two loxP sites in the Nph3-KI allele, a Nph3-KO mouse line was established by mating Nph3-KI with Cre-expressing transgenic mice. A double Nph1/Nph3-KO mouse line was also generated by mating Nph3-KO with Nph1-KO mice, already existing in the laboratory (Missler et al., 1998). In parallel to the in vivo approach, a bacterial protein expression system was established, leading to the production of recombinant Nph1 and Nph3 for use in future in vitro experiments.Analysis of Nph3 expression in Nph3-KI mice was performed by assaying brain sections for beta-galactosidase activity, based on the co-expression of beta-galactosidase from Nph3-expressing cells. This method revealed the Nph3 expression pattern with high accuracy and sensitivity, suggesting a novel approach for the detailed in vivo identification of cells that express a particular protein. A highly localized Nph3 expression pattern was observed with the most characteristic area of expression being the deep layers of the neocortex, where a band of expressing cells persisted throughout ontogeny and adulthood. In addition, expression of Nph3 was observed in a number of transient cell populations in the marginal zone of the developing neocortex, the dentate gyrus of the hippocampal formation and the granule cell layer of lobules 9 and 10 of the cerebellum, where low expression levels were also observed in adulthood. Neurons of the nasal epithelium and the vomeronasal organ were also shown to express Nph3 in embryonic stages. Most of the above cell populations are among the earliest in the brain and are important for the formation of the respective structures, implying a role of Nph3 in brain development.The above results, together with findings about the existence of neurexophilins in other organisms, as revealed by DNA database search, excluded a possible function of neurexophilins as structural co-factors of alpha-neurexins and supported the concept that neurexophilins perform a signaling function, regulating the role of alpha-neurexins at the synapse. The question that now arises is what is the exact function of neurexophilins in the brain. This can be adressed by electrophysiological analysis of the double Nph1/Nph3-KO mouse line, as well as by in vitro experiments using recombinant neurexophilins.de
dc.contributor.coRefereeStumpner, Andreas Prof. Dr.de
dc.subject.topicMathematics and Computer Sciencede
dc.subject.gerNeurexophilinde
dc.subject.gerNeurexinde
dc.subject.gerSynapsede
dc.subject.gerNeuropeptidde
dc.subject.gerZentralnervensystemde
dc.subject.gerTransgene Mausde
dc.subject.gerEmbryonalle Stammzellende
dc.subject.engneurexophilinde
dc.subject.engneurexinde
dc.subject.engsynapsede
dc.subject.engneuropeptidede
dc.subject.engcentral nervous systemde
dc.subject.engtransgenic mousede
dc.subject.engembryonic stem cellsde
dc.subject.bk42.13de
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1120-5de
dc.identifier.purlwebdoc-1120de
dc.affiliation.instituteBiologische Fakultät inkl. Psychologiede
dc.subject.gokfullWF 000: Molekularbiologie, Gentechnologiede
dc.identifier.ppn353786209


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