Umwelt-Genomik als Quelle für die Isolierung von neuen Operons und Genclustern aus mikrobiellen Konsortien
Environmental Genomics as a source for the isolation of new operons and gene clusters from microbial consortia
Plamena Entcheva
Doctoral thesis
Date of Examination:
2002-01-29
Date of issue:
2002-10-15
Advisor:
Streit, Wolfgang Dr.
Referee:
Liebl, Wolfgang Prof. Dr.
Referee:
Gottschalk, Gerhard Prof. Dr.
Persistent Address: http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-ABF3-9
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Name:
entcheva.pdf
Size:
6,4 MB
Format:
PDF
Description:
Dissertation
Abstract
English
The main goal of the present work was the isolation of biotin biosynthesis genes and operons from microbial consortia employing a combined enrichment and direct cloning strategy. Cosmid libraries with large inserts of DNA (>30 kb) were constructed from enrichment cultures, which had been inoculated with different environmental samples. The cosmid libraries were screened for clones containing complete biotin biosynthesis operons (bio-operons) by functional complementation in E. coli. Altogether, six cosmid clones were identified that produced significant amounts of biotin. Sequence analysis of the complete cosmid clones identified six bio-operons and many other novel genes. Biotin synthesis rates of the tested clones were highly variable and ranged from just a few pg/ml to 3,800 pg/ml in defined medium. Because the clone designated pCosHE2 showed the highest biotin biosynthesis rates the corresponding bio-operon was subcloned into different vectors and the constructs were transferred into bacteria from nine different genera to test the potency for commercial biotin production. Hosts for the expression of the environmentally derived bio-genes included Corynebacterium glutamicum, Sinorhizobium meliloti, Rhizobium sp. NGR234, Rhizobium etli, Ralstonia eutropha, Agrobacterium tumeafciens, Klebsiella planticola, Escherichia coli and Xanthomonas campestris. Surprisingly, significant amounts of biotin (> 0.2 mg/l) were synthesized only in E. coli carrying extra copies of the pCosHE2 derived bio-operon. Up to 3.5 mg/l biotin were found in culture supernatant of recombinant E. coli strains grown on defined media in batch cultures. Additional studies focused on regulatory aspects linked to biotin biosynthesis and biotin uptake in gram-negative bacteria. For this purpose 2-dimensional gel electrophoresis was employed and this work has led to the identification of several proteins involved in the biotin-regulatory network.
Keywords: environmental genomics; metagenomics; gene library; biotin biosynthesis
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Zentraler Aspekt dieser Arbeit war die Isolierung von neuartigen Biotinbiosyntheseoperons aus mikrobiellen Konsortien mit Hilfe kombinierter Anreicherung und direktem Klonieren. Hierzu wurden Cosmid-Genbanken aus Anreicherungskulturen mit einer Fragment-Größe von ca. 30 kb angelegt. Anschließend wurden die Genbanken auf Klone durchmustert, die möglicherweise Biotinbiosyntheseoperons (bio-Operons) tragen. Dabei wurden mit Hilfe funktionaler Komplementation sechs Cosmid-Klone identifiziert, die signifikante Mengen an Biotin produzierten. DNA-Sequenzanalysen der Cosmidklone zeigten, dass in allen Fällen vollständige bio-Operons vorhanden waren und die Sequenzanalysen identifizierten eine Reihe weiterer neuer Gene. Die Biotinproduktion der positiven Klone lag in einem Bereich von einigen pg/ml bis zu 3 800 pg/ml in definierten Medium. Aufgrund der sehr hohen Syntheseleistung wurde der Cosmid-Klon pCosHE2 für die Konstruktion von Biotin-überproduzierenden Mikroorganismen ausgewählt und das drauf enthaltende bio-Operon in verschiedene Vektoren kloniert. Diese bio-Konstrukte wurden in Bakterien aus neun verschiedenen Gattungen mobilisiert und anschleißend deren Biotinproduktionsfähigkeiten auf Mineralmedium getestet. Als Wirte für die Expression von Umwelt-isolierten bio-Genen wurden dabei Corynebacterium glutamicum, Sinorhizobium meliloti, Rhizobium NGR234, Rhizobium etli, Ralstonia eutropha, Agrobacterium tumeafciens, Klebsiella planticola, Escherichia coli und Xanthomonas campestris gewählt. Interessanterweise, nur E. coli-Stämme die das bio-Operon aus dem pCosHE2 überexprimierten, zeigten eine sehr hohe Biotinkonzentration (> 0,2 mg/l) im Kulturüberstan, wobei bis zu 3,5 mg/l Biotin gemessen wurden. Weitere Arbeiten konzentrierten sich auf die Analyse regulatorischer Phänomene bei Biotinsynthese und Aufnahme. Mit Hilfe von 2D-Gelelektrophorese wurden einige Proteine identifiziert, die in Zusammenhang mit dem Biotin-regulatorischen Netzwerk in gram-negativen Bakterien stehen.
Schlagwörter: Umwelt-Genomik; Metagenomik; Genbanken; Biotin Biosynthese
