DAHP Synthasen aus Pilzen

Abstract

Der erste Schritt der aromatischen Aminosäurebiosynthese ist die Kondensation von Erythrose-4-Phosphat und Phosphoenolpyruvat zu 3-Desoxy-D-arabino-Heptulo-sonat 7-Phosphat. Diese Reaktion wird durch die DAHP Synthase (EC 4.1.2.15) katalysiert. Abhängig vom Organismus handelt es sich hierbei um ein Isoenzym-System von zwei bis drei Enzymen, die entweder unreguliert oder durch jeweils ein Endprodukt, Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan negativ reguliert werden. Die Hefe Saccharomyces cerevisiae besitzt zwei DAHP Synthasen, die durch Tyrosin oder Phenylalanin inhibierbar sind. Im Gegensatz dazu besitzt E. coli neben diesen beiden Regulationsarten noch ein drittes Isoenzym, welches Tryptophan-regulierbar ist. Dieses E. coli Enzym kann stabil heterolog in Hefe exprimiert werden. Das Genprodukt kann einen Hefestamm retten, der bei Inhibierung der eigenen DAHP Synthasen durch Tyrosin und Phenylalanin die allgemeine Kontrolle der aromatischen Biosynthese nicht mehr einschalten kann (Dgcn4). Zufallsmutagenesen und zielgerichtete Mutagense haben gezeigt, dass bei der Regulation der Tryptophan-inhibierbaren DAHP Synthase Aminosäurereste eine Rolle spielen, die bei den anderen beiden DAHP Synthasen nicht an der Inhibierung beteiligt sind. Im filamentös wachsenden Pilz Aspergillus nidulans wurden zwei DAHP Synthasen identifiziert und charakterisiert. Die beiden neuen Isoenzyme werden durch Tyrosin oder Phenylalanin inhibiert und tragen ein zweiwertiges Metallatom als Kofaktor. Beide Enzyme lassen sich im Gegensatz zu den bisher bekannten DAHP Synthasen nicht vollständig durch EDTA inhibieren. Zwischen beiden Isoenzymen besteht ein Feinregulierungssystem, die es dem Pilz ermöglicht den Kohlenstofffluss in den Shikimat-Weg exakt zu kontrollieren. Um die Funktionsweise der DAHP Synthase genauer verstehen zu können, wurde die Proteinstruktur der Tyrosin-inhibierbaren DAHP Synthase aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae bestimmt. Hierbei handelt es sich um einen TIM barrel Fold mit einigen zusätzlichen Bestandteilen. Durch verschiedene Mutgenese-Techniken wurde festgestellt, dass diese zusätzlichen Teile der Struktur wesentlich an der Regulierung des Enzyms beteiligt sind. Um die Regulation zwischen Tyrosin und Phenylalanin auszutauschen bedarf es den Austausch einer einzigen Aminosäure, Glycin 226 (Serin im entsprechenden Isoenzym).