DIFFERENTIAL GENE EXPRESSION DURING ISCHEMIA AND REPERFUSION IN AN EXTRACORPOREAL SMALL BOWEL PERFUSION MODEL IN SWINE
Differentielle Genexpression während Ischämie und Reperfusion im Modell der extrakorporalen Dünndarmperfusion am Schwein
by Seyed Mehdi Hosseini
Date of Examination:2002-10-30
Date of issue:2002-12-04
Advisor:Prof. Dr. Burckhardt Ringe
Referee:Prof. Dr. Rüdiger Hardeland
Referee:Prof. Dr. Dr. Wolfgang Engel
Files in this item
Name:hosseini.pdf
Size:2.45Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
In a perfusion model using isolated small intestine of the pig, a strong inflammatory reaction with cytokine release and induction of corresponding mRNA expression was shown during reperfusion with whole blood. This reaction already occurred during cold ischemia time (CIT), being far more pronounced after 20h CIT than after 2h CIT. Reperfusion can cause mucosal damage, whereby a prolonged CIT leads to an earlier and initially greater mucosal damage after reperfusion. As an expression of the inflammatory reaction mediated by ischemia-reperfusion injury (IRI), we observed an increased expression of IL-6, IL-2, HSP70, IFN-gamma, and E-selectin. Using in-situ-hybridization, we were able to detect the mRNA expression of IL-6 not only in immuncompetent cells but also in endothelial, smooth muscle, and ganglia cells. Therefore it may be deducted that these cells also, besides the immuncompetent cells, play a considerable role in the initiation of intestinal IRI. For the first time, we succeeded in locating the mRNA expression of IL-2, HSP70, and E-selectin in small intestinal tissue using in-situ-hybridization. The E-selectin mRNA expression was found in endothelial cells. Since these effects occurred shortly after reperfusion and may possibly contribute to the IRI, E-selectin may function as a Clinical marker for the activation of endothelial cells. We were further able to identify a number of up- and downregulated genes by differential display, among these swine leukocyte antigen, SLA-DQ (MHC class II), whose mRNA expression is upregulated immediately after reperfusion. MHC class II is of high significance for transplant antigenicity. Alpha-NAC, GUCY1B3, TCF7, TIS11, TRIP7, and the SMH1 gene, named by us, may function as transcription factors, while SNAP23, UHRF1, DDEF1, FAT, RPL3, and STK12 seem to play a role in differentiation and Proliferation processes. In our experiments, we discovered four more genes that where not yet identified in the pig. We registered them with the GeneBank: The FAT tumor suppressor gene belongs to the cadherine superfamily and takes part in cell-cell-interaction, STK phosphorylates proteins of early inflammation, RPL3 takes part in peptidyltransferase center formation and is essential to its catalytic activity, and Son-DNA-binding protein of yet unknown function. The overexpression of the recombinant protein, however, can change cell morphology. Finally, we identified during reperfusion a differential down regulated still unknown gene, which we called SMH-1. This gene possesses a homology to a human DNA sequence exhibiting a just shortly discovered zinc finger protein. SMH-1 seems to be a regulation gene during hypoxia, but its function is not yet fully known. The mRNA differential display seems to be a suitable method for detecting genes that are differentially expressed during intestinal IRI. We were able to identify genes not yet discussed in the pathophysiology of IRI, but that may potentially play a role in the injury and reparation processes. The differential genes detected in our experiments could serve further understanding of the pathophysiology of IRI and may act as potential targets for therapeutic intervention.
Keywords: ischemia-reperfusion; differential display; IL-6; IL-2; HSP70; IFN-gamma; E-selectin
Other Languages
Anhand des isoliert perfundierten Schweinedünndarms haben wir gezeigt, dass es besonders während der Reperfusion mit Schweinevollblut zu einer starken Entzündungsreaktion mit Freisetzung von Zytokinen und einer Induktion der entsprechenden mRNA-Expression kommt. Diese Reaktion zeigte sich schon während der kalten Ischämiezeit, wobei sie nach 20 Stunden KIZ deutlich ausgeprägter war als nach 2 Stunden. Nach Reperfusion kam es zu einer mukosalen Schädigung, wobei eine verlängerte kalte Ischämiezeit zu einer frühzeitigeren und initial schwereren mukosalen Schädigung nach Reperfusion führte. Als Ausdruck der Ischämie-Reperfusionsschaden-vermittelten Entzündungsreaktion beobachteten wir eine zunehmende Expression von IL-6, IL-2, HSP70, IFN-Gamma und E-Selektin. Durch In-situ-Hybridisierung konnten wir die mRNA-Expression von IL-6 nicht nur in immunkompetenten Zellen, sondern sogar in Endothel-, glatten Muskel- und Ganglienzellen nachweisen. Daraus scheint zu folgen, dass auch diese Zellen, neben den immunkompetenten Zellen, eine wesentliche Rolle bei der Initiierung des intestinalen Ischämie-Reperfusionsschadens spielen. Erstmals gelang uns mittels In-situ-Hybridisierung die Lokalisation der mRNA-Expression von IL-2, HSP70 und E-Selektin in Dünndarmgewebe. Dabei fand sich E-Selektin mRNA-Expression in Endothelzellen. Da diese Effekte früh nach Reperfusion auftraten und möglicherweise einen Beitrag zum Ischämie-Reperfusionsschaden leisten, bietet es sich an, E-Selektin als Marker für eine Aktivierung der Endothelzellen zu verwenden. Des weiteren konnten wir mittels Differential Display eine Vielzahl von hoch- und herunterregulierten Genen identifizieren, darunter das Schweine-Leukozytenantigen SLA-DQ (MHC Klasse II), dessen mRNA-Expression unmittelbar nach Reperfusion hochreguliert wird. MHC Klasse II ist für die Antigenität von Transplantaten von ausschlaggebender Bedeutung. Für alpha-NAC, GUCY1B3, TCF7, TIS11, TRIP7 und das von uns genannte SMH-1 Gen kommt eine Rolle als Transkriptionsfaktor in Frage, während SNAP23, UHRF1, DDEF1, FAT, RPL3 und STK12 an Differenzierungs- und Proliferationsprozessen beteiligt zu sein scheinen. Bei unseren Versuchen entdeckten wir außerdem vier, beim Schwein bisher nicht bekannte, Gene, die wir in der GenBank registrieren ließen: Das zur Cadherin-Superfamilie gehörende FAT Tumor-Suppressor-Gen, welches an der Zell-Zell-Interaktion beteiligt ist, STK, welches Proteine der frühen Entzündungsreaktion phosphoryliert, RPL3, welches an der Bildung des Peptidyltransferasezentrums beteiligt ist und für dessen katalytische Aktivität essentiell ist sowie Son-DNA-bindendes Protein, dessen Funktion bis heute unklar ist. Die Überexpression des rekombinanten Proteins kann jedoch die Zellmorphologie verändern. Schließlich identifizierten wir ein während der Reperfusion differentiell herunterreguliertes, bisher gänzlich unbekanntes Gen, welches wir SMH-1 nannten. Dieses Gen besitzt eine Homologie zu einer humanen DNA-Sequenz, die einen Teil eines kürzlich entdeckten Zink-Fingerproteins aufweist. Es scheint ein Hypoxie reguliertes Gen zu sein, dessen Funktion noch nicht näher bekannt ist. Das mRNA-Differential Display erscheint als geeignete Methode zur Detektion von Genen, die bei der intestinalen Ischämie-Reperfusionsschädigung differentiell exprimiert werden. Wir konnten Gene nachweisen, die bislang nicht in der Pathophysiologie des Ischämie-Reperfusionsschadens diskutiert wurden und eine potentielle Rolle bei den hierdurch hervorgerufenen Schädigungs- und Reperaturprozessen spielen. Die in unserer Arbeit detektierten differentiellen Gene können der weiteren Aufklärung der Pathophysiologie des Ischämie-Reperfusionsschadens dienen und stellen potentielle Angriffspunkte für therapeutische Interventionen dar.
Schlagwörter: Ischämie-Reperfusion; Differential Display; IL-6; IL-2; HSP70; IFN-Gamma; E-Selektin