Functional studies on the transmembrane protein encoded by the TM20 gene in maize
Funktionelle Studien des Transmembranproteins, das codiert wird durch das Gen TM20
by Torben Jahrmann
Date of Examination:2002-04-24
Date of issue:2002-05-03
Advisor:Prof. Dr. Dietrich Gradmann
Referee:Prof. Dr. Christiane Gatz
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
In the course of the analysis of lachrima, a recessive, defective kernel, embryo-lethal mutation in Zea mays that blocks embryo and endosperm development at transition stage, a gene coding for a new class of transmembrane proteins was isolated. The predicted protein contains twenty hydrophobic segments that can be grouped in five repeats formed by four segments that fulfil the criteria for membrane spanning domains, and for this reason the gene has been named TM20 (transmembrane 20). The phenotype of lachrima displays a high similarity to wild-type embryos grown in the presence of an excess of auxin. This, together with the structural characteristics of a protein with transporter function gives rise to the hypothesis that TM20 is related to the mechanism of auxin-transport. In this study the localization of TM20 in the maize embryo and at the subcellular level was investigated and its possible involvement in auxin transport processes by expression of TM20 in heterologous systems. With the aim of localizing TM20 by immunological methods various antibodies were raised against specific zones of the protein and the association of TM20 to membranes demonstrated by western and dot blot analysis. TM20 was detected in maize embryos of different developmental stages in the leaf primordia, the shoot apical meristem, the radicle and in cell layers surrounding the provascular tissue. At the subcellular level TM20 is located mainly at the apical part of the cells in a polar manner. A similar polar localization at the basal or the apical part of the cell was described also for the putative auxin carriers from Arabidopsis PIN1, PIN2 and AUX1. Furthermore, the definition of the polarized pattern of TM20 seems to be dependent on the developmental stage of the cells, since no polarisation of TM20 was found in young embryos (10DAP) or in the undifferentiated cells of the shoot apical meristem. With the purpose of testing whether TM20 transports indole acetic acid (IAA) the protein was expressed in oocytes of Xenopus laevis. The transport assays showed that radiolabeled IAA entered the cells by diffusion depending on the pH of the medium. Moreover, oocytes expressing TM20 accumulate up to 50% less IAA after 60 min of transport than the corresponding controls, pointing to an IAA-efflux activity of TM20. The addition of the known auxin transport inhibitor N-1-Naphthylphtalamic acid (NPA) reduced the accumulation of IAA in TM20 expressing oocytes to levels of the control oocytes, indicating the specifity of the observed transport effect. An extensive search in the databases lead to possible homologues of TM20 in Oryza sativa, Arabidopsis and Hordeum vulgare. The in silico analysis of these homologues and the cloning of a TM20-like cDNA from Arabidopsis by RT-PCR suggests the presence of TM20 in more plant species. The results of the immunohistochemistry and the observed transport ability of TM20 suggests the involvement of TM20 in the formation of an auxin gradient in the plant.
Keywords: Zea mays; maize; auxin; transmembrane; dek mutants
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Im Verlauf der Untersuchung der rezessiven, embryo-lethalen defective kernel (dek) Mutante lachrima von Zea mays ist ein Gen isoliert worden, das für eine neue Klasse von Transmembranproteinen kodiert. Die Mutation blockiert die Entwicklung von Embryo und Endosperm in der Transitionsphase. Die vohergesagte Proteinstruktur zeichnet sich durch zwanzig hydrophobe Segmente aus, die in f ünf Gruppen von je vier Segmenten zusammengefasst werden können. Die 20 Segmente erfüllen die Charakteristik von Transmembrandomänen und aus diesem Grund wurde das gefundene Protein TM20 (Transmembrane 20) genannt. Der Phänotyp von lachrima weist eine hohe Ähnlichkeit zu Wildtyp-Embryonen auf, die in der Gegenwart von hohen Auxin-Dosen oder unter Zugabe von Auxin-Transport Inhibitoren kultiviert wurden. Diese Tatsache und die transporterähnliche Struktur des Proteins führt zu der Hypothese, dass TM20 ein Teil der Auxin-Transport Maschinerie sein könnte. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Lokalisierung von TM20 im Maisembryo und auf subzellulärer Ebene untersucht und durch Exprimierung in heterologen Systemen die Auxin-Transportfähigkeit von TM20 getestet. Mit dem Ziel TM20 unter Verwendung immunologischer Methoden zu lokalisieren, wurden verschiedene Antikörper gegen spezifische Bereiche hergestellt. Die Antikörper wurden in Western-Blot und Dot-Blot Versuchen geprüft und die Lokalisierung von TM20 in Membranfraktionen von Maisembryonen konnte damit gezeigt werden. In Wildtyp Maisembryonen verschiedener Entwicklungsstadien wurde TM20 überwiegend in jungen Blättern, im Apikalmeristem, in der Wurzel und in Zellschichten, die das provaskuläre Gewebe umschliessen, gefunden. In der Zelle ist TM20 hauptsächlich im apikalen Bereich lokalisiert, was zu einer polaren Gesamtverteilung in der Zelle führt. Eine ähnliche polare Verteilung im apikalen, sowie im basalen Teil der Zelle ist schon für die putativen Auxintransporter von Arbidopsis thaliana PIN1, PIN2 und AUX1 beschrieben worden. Darüberhinaus wurde gezeigt, dass das polare Verteilungsmuster von TM20 von der Entwicklungphase der Zellen abhängig ist. Die noch undifferenzierten Zellen des jungen Embryo (10 Tage nach der Bestäubung, 10DAP), sowie die undifferenzierten Zellen des Sprossmeristems weisen diese polare Verteilung nicht auf. Mit dem Ziel die indole acetic acid (IAA) - Transporteigenschaft von TM20 zu testen wurde TM20 in Xenopus laevis Oozyten exprimiert. Die Transportstudien zeigten, dass radioaktivmarkiertes IAA durch Diffusion in die Oozyten unter Abhängigkeit vom pH des Aussenmediums eindringt. Darüberhinaus akkumulieren Oozyten, die TM20 exprimieren, bis zu 50% weniger IAA nach 60min Inkubationszeit, als die mit Wasser injiziierten Kontrolloozyten. Dieses Ergebnis weist auf die IAA-Transportaktivität von TM20 hin. Die Zugabe von Phtalsäure (N-1-Naphthylphtalamic acid; NPA) bewirkt eine fast totale Angleichung der IAA Akkumulation in TM20 exprimierenden Oozyten und Kontrolloozyten. Die Suche nach TM20 in verschiedenen Datenbanken führte zu möglichen Homologen in Oryza sativa, Arabidopsis thaliana und Hordeum vulgare. Die in silico Analysen und die Klonierung von TM20-ähnlicher cDNA aus Arabidopsis durch RT-PCR, deutet darauf hin, dass TM20 auch in anderen Pflanzen zu finden ist. Die Ergebnisse der immunohistochemischen Studien und die beobachtete IAA-Transporteigenschaft von TM20 weisen ferner darauf hin, dass TM20 wahrscheinlich an dem Aufbau eines essentiellen Auxin Gradienten in der Pflanze beteiligt ist.
Schlagwörter: Zea mays; Mais; Auxin; transmembran; dek mutante