Functional studies on the transmembrane protein encoded by the TM20 gene in maize

Abstract

Im Verlauf der Untersuchung der rezessiven, embryo-lethalen defective kernel (dek) Mutante lachrima von Zea mays ist ein Gen isoliert worden, das für eine neue Klasse von Transmembranproteinen kodiert. Die Mutation blockiert die Entwicklung von Embryo und Endosperm in der Transitionsphase. Die vohergesagte Proteinstruktur zeichnet sich durch zwanzig hydrophobe Segmente aus, die in f ünf Gruppen von je vier Segmenten zusammengefasst werden können. Die 20 Segmente erfüllen die Charakteristik von Transmembrandomänen und aus diesem Grund wurde das gefundene Protein TM20 (Transmembrane 20) genannt. Der Phänotyp von lachrima weist eine hohe Ähnlichkeit zu Wildtyp-Embryonen auf, die in der Gegenwart von hohen Auxin-Dosen oder unter Zugabe von Auxin-Transport Inhibitoren kultiviert wurden. Diese Tatsache und die transporterähnliche Struktur des Proteins führt zu der Hypothese, dass TM20 ein Teil der Auxin-Transport Maschinerie sein könnte. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Lokalisierung von TM20 im Maisembryo und auf subzellulärer Ebene untersucht und durch Exprimierung in heterologen Systemen die Auxin-Transportfähigkeit von TM20 getestet. Mit dem Ziel TM20 unter Verwendung immunologischer Methoden zu lokalisieren, wurden verschiedene Antikörper gegen spezifische Bereiche hergestellt. Die Antikörper wurden in Western-Blot und Dot-Blot Versuchen geprüft und die Lokalisierung von TM20 in Membranfraktionen von Maisembryonen konnte damit gezeigt werden. In Wildtyp Maisembryonen verschiedener Entwicklungsstadien wurde TM20 überwiegend in jungen Blättern, im Apikalmeristem, in der Wurzel und in Zellschichten, die das provaskuläre Gewebe umschliessen, gefunden. In der Zelle ist TM20 hauptsächlich im apikalen Bereich lokalisiert, was zu einer polaren Gesamtverteilung in der Zelle führt. Eine ähnliche polare Verteilung im apikalen, sowie im basalen Teil der Zelle ist schon für die putativen Auxintransporter von Arbidopsis thaliana PIN1, PIN2 und AUX1 beschrieben worden. Darüberhinaus wurde gezeigt, dass das polare Verteilungsmuster von TM20 von der Entwicklungphase der Zellen abhängig ist. Die noch undifferenzierten Zellen des jungen Embryo (10 Tage nach der Bestäubung, 10DAP), sowie die undifferenzierten Zellen des Sprossmeristems weisen diese polare Verteilung nicht auf. Mit dem Ziel die indole acetic acid (IAA) - Transporteigenschaft von TM20 zu testen wurde TM20 in Xenopus laevis Oozyten exprimiert. Die Transportstudien zeigten, dass radioaktivmarkiertes IAA durch Diffusion in die Oozyten unter Abhängigkeit vom pH des Aussenmediums eindringt. Darüberhinaus akkumulieren Oozyten, die TM20 exprimieren, bis zu 50% weniger IAA nach 60min Inkubationszeit, als die mit Wasser injiziierten Kontrolloozyten. Dieses Ergebnis weist auf die IAA-Transportaktivität von TM20 hin. Die Zugabe von Phtalsäure (N-1-Naphthylphtalamic acid; NPA) bewirkt eine fast totale Angleichung der IAA Akkumulation in TM20 exprimierenden Oozyten und Kontrolloozyten. Die Suche nach TM20 in verschiedenen Datenbanken führte zu möglichen Homologen in Oryza sativa, Arabidopsis thaliana und Hordeum vulgare. Die in silico Analysen und die Klonierung von TM20-ähnlicher cDNA aus Arabidopsis durch RT-PCR, deutet darauf hin, dass TM20 auch in anderen Pflanzen zu finden ist. Die Ergebnisse der immunohistochemischen Studien und die beobachtete IAA-Transporteigenschaft von TM20 weisen ferner darauf hin, dass TM20 wahrscheinlich an dem Aufbau eines essentiellen Auxin Gradienten in der Pflanze beteiligt ist.