Analyse des Transkriptionsfaktors TGA2.1 aus Nicotiana tabacum

Abstract

Zur Aufklärung der spezifischen Rolle von TGA2.1 sollten transgene TGA2.1-Überexpressionspflanzen sowie TGA2.1-transdominante Suppressor-Linien erzeugt werden. Die subzellullare Lokalisation der transgenen Proteine sollte durch Western-Blot-Analysen und DNA-Bindungsstudien untersucht werden. Weiterhin sollte die Auswirkung der veränderten TGA2.1-Mengen auf Zielgene nach Induktion mit Salizylsäure, Auxin und Methyljasmonat untersucht und die Ergebnisse mit denen analoger Experimente mit TGA2.2-Überexpressionspflanzen verglichen werden. Komplementierend zu den Überexpressionspflanzen sollten transdominante Suppressorpflanzen mit einem in der DNA-Bindungsdomäne mutierten TGA2.1 erzeugt werden. Die analogen Experimente wie im Falle der TGA2.1-Überexpressionpflanzen sollten das Bild von der spezifischen Rolle von TGA2.1 ergänzen und im Zusammenhang mit den Ergebnissen aus bereits vorliegenden TGA2.2-Experimenten interpretiert werden. Da in früheren Veröffentlichungen nicht eindeutig nachzugewiesen werden konnte, ob der SARP-Komplex neben TGA2.2 auch TGA2.1 enthält oder positive Nachweisreaktionen mit einer Kreuzreaktionen des Antikörpers zu erklären waren, und ob die im Western-Blot detektierte Bande somit als gekürzte Formen von TGA2.1 oder durch ein weiteres Protein zu interpretieren war, sollte die Zusammensetzung des SARP-Komplexes untersucht werden. Sollte sich herausstellen, dass es sich bei den nachgewiesenen Protein um TGA2.1 handelt, galt es zu klären, ob die Prozessierung des Proteins eine physiologische Relevanz hat oder ein Produkt des Zellaufschlusses ist. Im letzteren Fall sollten geeignetere Proteinextraktionsmethoden entwickelt werden. Ein Affinitätstag am C-Terminus von TGA2.1 sollte verwendet werden, um die absoluten Mengen des transgenen TGA2.1 mit denen des transgenen TGA2.2 zu vergleichen und um darüber hinaus die Lokalisation der möglichen Deletion von TGA2.1 zu klären. Da bei den vorliegenden transgenen TGA2.2-Pflanzen die Zellkernproteinfraktion nicht untersucht worden war, wurden diese in die Untersuchungen des ASF-1-Komplexes mit einbezogen.