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Regulation of nitrogen fixation in Klebsiella pneumoniae: NifL, one protein transducing two environmental signals to the nif-transcriptional activator NifA

dc.contributor.advisorSchmitz-Sreit, Ruth Prof. Dr.de
dc.contributor.authorKlopprogge, Kai Gerhardde
dc.date.accessioned2012-04-16T14:46:50Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:21Zde
dc.date.issued2002-01-15de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-AC02-0de
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-120
dc.description.abstractKlebsiella pneumonia moduliert NifL die Aktivität des Transkriptionsaktivators NifA in Abhängigkeit der Umweltsignale Stickstoff und Sauerstoff. NifL ist ein Flavoprotein, welches das Sauerstoffsignal wahrscheinlich durch einen redoxsensitiven Konformationswechsel transduziert. Wir haben die Redoxeigenschaften von NifL, welches heterolog in Escherichia coli in Anwesenheit von molekularem Sauerstoff und unterschiedlicher Stickstoffquellen exprimiert wurde, untersucht. FAD Analysen haben gezeigt, dass gereinigtes NifL den FAD-Kofaktor unabhängig von der Sauertoff-und Stickstoffquelle während der Synthese trägt. Das Redoxpotential von NifL, welches in Anwesenheit von Ammonium als Stickstoffquelle synthetisiert wurde, betrug 277 ±5 mV bei pH 8.0 und 25 °C. Wurde NifL unter stickstofflimitierenden Bedingungen synthetisiert, betrug das Redoxpotential 274 ±6 mV bei pH 8.0 und 25 °C. Vollständig reduziertes NifL, ob unter stickstofflimitierenden oder nichtlimitierenden Bedingungen synthetisiert, reoxidierte schnell in Anwesenheit von molekularem Sauerstoff. Diese Resultate lassen den Schluss zu, dass die Stickstoffquelle während der Synthese das Redoxpotential des NifL gebundenen FADs nicht beeinflusst. Die beiden NifL Fraktionen wiesen allerdings den Unterschied auf, dass eine nicht flavinspezifische Absorption im uv/vis-Spektrum bei 420 nm nur bei NifL, welches in Anwesenheit von Ammonium synthetisiert wurde, auftrat. Durch die Beobachtung der NifA abhängigen Expression von K. pneumoniae ø(nifH-lacZ)-Fusionen in verschiedenen genetischen Hintergründen haben wir die Sauerstoffregulation der NifL Aktivität in E. coli and K. pneumoniae Stämmen untersucht. In Stämmen beider Organismen mit fnr-Deletionen konnte die Inhibierung von NifA durch NifL nicht durch Abwesenheit von Sauerstoff dereprimiert werden. Diese Phänotypen konnten durch die Synthese von Fnr in trans komplementiert werden. Fnr scheint also, direkt oder indirekt, an der NifL abhängigen Sauerstoffkontrolle der nif-Gene beteiligt zu sein. Die Rolle von Fnr in der nif-Regulation könnte in der transkriptionellen Kontrolle von Genen der Atmungskette liegen. Deshalb untersuchten wir die Lokalisation von NifL. 55 % des NifL wurde in K. pneumoniae, aerob und stickstofflimitiert gewachsen, in der Membranfraktion gefunden. Wenn die K. pneumoniae Zellen anaerob angezogen wurden und von stickstofflimitierenden Bedingungen auf nichtlimitierende Bedingungen gewechselt wurden, fand sich nur 10 % des NifL in der Membranfraktion. Die unter dereprimierende Bedingungen höhere Membranaffinitaet von NifL scheint also, eine räumliche Trennung von NifL und dem Transkriptionsaktivator NifA herzustellen. Lokalisationsexperimente mit dem primären Stickstoffsensor GlnK zeigten außerdem, dass unter stickstofflimitierenden Wachstumsbedingungen unabhängig von der Anwesenheit von molekularem Sauerstoff, 15- 20 % des GlnK membranassoziiert vorliegt. Ein Wechsel zu Stickstoffsättigung resultierte in der raschen Degradation des cytosolischen GlnK. Das membranassoziierte GlnK zeigte eine sehr viel längere Halbwertszeit. Daraus resultiert, dass ein proteolytischer Abbau von GlnK der Mechanismus für die Aktivierung von NifL beim Wechsel zu Stickstoffsättigung sein könnte. Die inhibitorische Aktivität von NifL konnte in vitro durch die Anwesenheit von ATP und ADP gesteigert werden, wenn NifL unter Stickstoffsättigung synthetisiert wurde (NifLNH4). Interessanterweise war NifLNH4 in der Lage ATP zu hydrolisierten (2500 mU/mg). Im Gegensatz dazu wurde die inhibitorische Aktivität von NifL, welches unter stickstofflimitierenden Bedingungen synthetisiert wurde, nicht von Adeninnukleotiden beeinflusst und zeigte auch keine ATP-Hydrolyseaktivität. Dies lässt den Schluss zu, dass die Stimulation der inhibitorischen Aktivität von NifL auf einer bestimmten Konformation beruht, die durch Ammonium induziert wird. Unsere Hypothese ist, dass die Anwesenheit von Ammonium die Konformation von NifL dahingegen verändert, dass NifL die Energie der ATP-Hydrolyse zur Bildung von NifL-NifA-Komplexen nutzen kann.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isogerde
dc.rights.urihttp://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyrdiss.htmde
dc.titleRegulation of nitrogen fixation in Klebsiella pneumoniae: NifL, one protein transducing two environmental signals to the nif-transcriptional activator NifAde
dc.typedoctoralThesis
dc.title.translatedRegulation der Stickstoffixieung in Klebsiella pneumoniae: NilL, ein Protein, das zwei Umweltsignale auf den nif-Transkriptionsaktivator NifA überträgtde
dc.contributor.refereeLiebl, Wolfgang Prof. Dr.de
dc.date.examination2001-05-03de
dc.subject.dnb570 Biowissenschaften, Biologiede
dc.description.abstractengKlebsiella pneumoniae, NifL modulates the activity of the transcriptional activator NifA in response to combined nitrogen or external molecular oxygen. We recently showed that K. pneumoniae NifL is a flavoprotein which apparently senses oxygen through a redox-sensitive, conformational change. We characterized the redox properties of NifL synthesized in Escherichia coli in the presence of different nitrogen sources. FAD analyses showed that purified NifL carried FAD as cofactor independent of nitrogen and oxygen availability. The redox potential of NifL synthesized in the presence of ammonium was 277 ±5 mV at pH 8.0 and 25° C, as determined by reduction with dithionite or with enzymatic reduction by xanthine oxidase in the presence of methyl viologen as redox mediator. When synthesized under nitrogen-limiting conditions, NifL showed a redox potential of - 274 ±6 mV at pH 8.0 and 25° C. Fully reduced NifL fractions, synthesized under either condition listed above, reoxidized rapidly in the presence of molecular oxygen. These results indicate that for NifL synthesized in E. coli, the redox potential of the NifL-bound FAD is not influenced by the nitrogen source. The two NifL fractions differed, however, in that a non-flavin specific absorbance at 420 nm was found only in NifL synthesized in the presence of ammonium. By monitoring the inhibition of NifA-mediated expression of K. pneumoniae ø(nifH-lacZ) fusions in different genetic backgrounds we have now studied the oxygen regulation of NifL activity in E. coli and K. pneumoniae strains. Strains of both organisms carrying fnr null mutations failed to release NifL inhibition of NifA transcriptional activity under oxygen limitation: nif induction was similar to the induction under aerobic conditions. When the transcriptional regulator Fnr was synthesized from a plasmid, it was able to complement, i.e., to relieve NifL inhibition in the fnr--backgrounds. Hence, Fnr appears to be involved, directly or indirectly, in NifL-dependent oxygen regulation of nif gene expression in K. pneumoniae. The data indicate that in the absence of Fnr NifL apparently does not receive the signal for anaerobiosis. We therefore hypothesize that in the absence of oxygen, Fnr, as the primary oxygen sensor, activates transcription of a gene(s) whose product(s) function to relieve NifL inhibition by reducing the FAD cofactor under oxygen-limiting conditions. Potentially, these Fnr-dependent gene products could be membrane-bound components of the anaerobic electron transport chain; consequently, in this study we have examined the localization of NifL within the cell under various growth conditions. In K. pneumoniae grown under oxygen and nitrogen-limited conditions approximately 55 % of the total NifL protein was found in the membrane fraction. However, when the cells were grown under aerobic conditions or shifted to nitrogen sufficiency significantly less membrane-associated NifL was detectable (less than 10 % of total NifL). These findings suggest that a significant higher membrane affinity of NifL under derepressing conditions may create a spatial gap between NifL and its target protein NifA impairing inhibition of NifA by NifL. Localization analysis of the primary nitrogen sensor GlnK further showed that under nitrogen-limited conditions but independent of oxygen presence 15 - 20 % of the total GlnK is membrane associated. A shift to nitrogen sufficiency resulted in rapid degradation of the cytosolic GlnK fraction, whereas the membrane associated GlnK fraction displayed a significantly longer half-life. These findings suggest that proteolytic cleavage of cytosolic GlnK may be the mechanism for restoration of NifL activity upon a shift to nitrogen sufficiency.The inhibitory function of Klebsiella pneumoniae NifL on NifA transcriptional activity in vitro increases upon addition of ATP and ADP, when NifL was synthesized under nitrogen sufficiency (NifLNH4). Interestingly, NifLNH4 also hydrolyzes ATP (2500 mU/mg). In contrary, NifL synthesized under nitrogen limitation is not affected by adenine nucleotides and exhibits no ATP hydrolyzing activity. These major differences indicate that stimulation of the inhibitory function and ATP-hydrolysis depend on a specific NifL conformation induced by ammonium. We hypothesize that the presence of ammonium alters the conformation of NifL, enabling NifL to use the energy of ATP-hydrolysis to form NifL-NifA complexes more efficiently.de
dc.contributor.coRefereeGottschalk, Gerhard Prof. Dr.de
dc.subject.topicMathematics and Computer Sciencede
dc.subject.gerNifLde
dc.subject.gerRegulationde
dc.subject.gerStickstoffixierungde
dc.subject.gerKlebsiella pneumoniaede
dc.subject.engNifLde
dc.subject.engregulationde
dc.subject.engnitrogen fixationde
dc.subject.engKlebsiella pneumoniaede
dc.subject.bk42.3de
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1183-5de
dc.identifier.purlwebdoc-1183de
dc.affiliation.instituteBiologische Fakultät inkl. Psychologiede
dc.subject.gokfullWUE 200: Stoffwechsel und Biochemie der Mikroorganismen {Mikrobiologie}de
dc.identifier.ppn344854876


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