Identifizierung und Charakterisierung eines Vsr-Homologen aus Bacillus stearothermophilus

Abstract

In dieser Arbeit wurde zunächst eine Methode entwickelt, mit deren Hilfe ausgehend von nur einer konservierten Aminosäureregion einer Proteinfamilie mittels PCR Fragmente unbekannter Gene isoliert werden können, die für diesen Block codierende Sequenzen besitzen. Diese Methode wurde zur Identifizierung eines Gens aus Bacillus stearothermophilus H3 angewandt, welches ein Homologes der Vsr-Endonuklease aus Escherichia coli kodiert. Vsr-Endonuklease aus Escherichia coli initiiert die Reparatur von Schäden an 5-Methylcytosin. Die Desaminierung in dsDNA erzeugt eine T/G-Fehlpaarung, die durch Vsr strangspezifisch 5' des fehlgepaarten Thymins gespalten wird. 5-Methylcytosin wird in Escherichia coli durch die Dcm-Methyltransferase an der Position des inneren Cytosins in der Erkennungssequenz CC(A/T)GG eingeführt. T/G-Fehlpaarungen, die innerhalb einer Sequenzumgebung liegen, welche auf Desaminierung an 5-Methylcytosin in diesem Kontext zurückgehen, werden von Vsr bevorzugt. Das Gen aus Bacillus stearothermophilus wurde kloniert, das Genprodukt heterolog in Escherichia coli produziert und über eine zusätzlich angefügte C-terminale Hexahistidinsequenz aufgereinigt. Das Protein spaltet T/G-Fehlpaarungen 5' des Thymins. Die Spaltung ist Mismatch- und Strangspezifisch. Das Enzym zeigt damit eine der Vsr-Endonuklease aus Escherichia coli vergleichbare Aktivität und wurde als Vsr.Bst bezeichnet. Dies ist die erste Beschreibung einer Aktivität eines Vsr-Homologen. Das Substratspektrum von Vsr.Bst wurde durch Messung relativer Geschwindigkeitskonstanten in multiplen Substratkinetiken durchgeführt. Die Untersuchung von 15 Substraten zeigte, daß Vsr.Bst im Vergleich mit Vsr aus Escherichia coli eine deutlich geringere Präferenz für den Sequenzkontext der T/G-Fehlpaarung aufweist. Vier der fünfzehn Substrate wurden sehr schlecht gespalten. Bei allen vier (und nur bei diesen) befand sich Thymin in direkter Nachbarschaft zu dem fehlgepaarten Thymin. Aus den verbleibenden elf Substraten konnte kein offensichtlicher Konsensus abgeleitet werden. Vsr.Bst spaltet T/G-Fehlpaarungen um den Faktor 2.5 besser als U/G-Fehlpaarungen, welche durch Desaminierung eines Cytosins entstehen können. Vsr.Bst scheint also im Wesentlichen für die Reparatur von Desaminierungsschäden am 5-Methylcytosin verantwortlich zu sein. Um eine Wechselwirkung zwischen Vsr.Bst und Enzymen der Mismatch-Reparatur in vitro untersuchen zu können, wurden ein MutL- und ein MutS-Homologes aus Bacillus stearothermophilus aufgereinigt. Mit dem in dieser Arbeit verwendeten System konnte keine Stimulierung der Vsr.Bst-Aktivität durch MutL und/oder MutS beobachtet werden. Die Möglichkeit einer Steigerung der Vsr.Bst-Aktivität durch diese Proteine konnte jedoch nicht ausgeschlossen werden. Eine Aussage hierzu erfordert weitere Untersuchungen. Vsr.Bst konnte 10 Minuten bei 50 °C inkubiert werden, ohne daß ein merklicher Aktivitätsverlust auftrat. Nach 30 Minuten bei 50 °C zeigte Vsr.Bst immer noch über 60 % Aktivität. Die beobachtete Stabilität macht das Enzym interessant für diagnostische Methoden, wie beispielsweise der Detektion von punktspezifischen Mutationen. Die kinetischen Daten von Vsr.Bst wurden am Beispiel eines schnell umgesetzten Substrates bestimmt. Mit KM=0.27 µM, vmax=0.25 µM/min-1 und einer Umsetzung von maximal 2.3 Substratmolekülen pro Minute ist Vsr.Bst ein vergleichsweise langsames Enzym. Verglichen mit Vsr aus Escherichia coli ist es etwa 14mal schneller. Da Bacillus stearothermophilus mit einem Wachstum bei höherer Temperatur auch höheren Desaminierungsraten begegnen muß, mag die Korrelation mit einer ebenfalls erhöhten Aktivität von Vsr.Bst kein Zufall sein.