Untersuchungen zur Inaktivierung und Reaktivierung der Coenzym B12-abhaengigen Glycerin-Dehydratasen aus Citrobacter freundii und Clostridium pasteurianum

Abstract

Die Coenzym B12 abhaengige Glycerin-Dehydratase aus Citrobacter freundii ist an der anaeroben Umsetzung von Glycerin involviert. Sie katalysiert die Dehydratisierung von Glycerin zu beta-Hydroxypropionaldehyd. Das Enzym unterliegt einer sogenannten ''Suicide''-Inaktivierung durch eben dieses S! ubstrat. Im Verlauf dieser Arbeit wurden dhaF und dhaG als Gene fuer einen Reaktivierungsfaktor der inaktivierten Glycerin-Dehydratase identifiziert. Northern Blot Analysen zeigten, dass die beiden Gene nur waehrend der Glycerinfermentation exprimiert werden. Das dhaF-Gen bildet zusammen mit den drei Strukturgenen der Glycerin-Dehydratase (dhaBCE) ein Operon. Das dhaG-Gen wird zusammen mit dem dhaT-Gen, welches fuer ein weiteres Schluesselenzym der Glycerinfermentation, die 1,3-Propandiol-Dehydrogenase, kodiert, transkribiert. Die His6-getaggten dhaF- und dhaG-Genprodukte wurden aus einem zellfreien Extrakt eines rekombinanten E. coli-Stammes bis zur Homogenitaet gereinigt. Beide Proteine bilden einen Komplex mit einer apparenten Molekularmasse von 150 kDa. Die Untereinheitenstruktur des nativen Komplexes ist alpha2beta2. Der Faktor ist in der Lage, die durch Glycerin oder O2 inaktivierte Glycerin-Dehydratase zu reaktivieren. Ebenso wird der inaktive Cyno-B12-Glycerin-Dehydra! tase-Komplex durch den Faktor reaktiviert. Alle Reaktivierungsreaktionen sind strikt abhaengig von der Zugabe von Coenzym B12, ATP und Mg2+. Sowohl der DhaFG-Komplex als auch DhaF allein besitzen eine ATP-hydrolysierende Aktivität, die jedoch nicht direkt mit der Reaktivierung der Dehydratase gekoppelt ist. Der gereinigte Komplex aus DhaFG aus C. freundii ist desweiteren in Lage , die durch Glycerin bzw Cyano-B12 inaktivierte Glycerin-Dehydratase aus Klebsiella pneumoniae zu reaktivieren. Dagegen zeigte der Komplex aus C. freundii keine Aktivitaet mit der Glycerin-Dehydratase aus Clostridium pasteurianum und Diol-Dehydratasen aus verschiedenen Enterobakterien.