Zur Kurzanzeige

Insulin-Like Growth Factor Binding Protein-6: Posttranslational modifications and sorting in polarized MDCK cells

dc.contributor.advisorFigura, Kurt von Prof. Dr. Dr. h.c.de
dc.contributor.authorShalamanova-Malinowski, Liliana Dimitrovade
dc.date.accessioned2012-04-16T14:46:58Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:47Zde
dc.date.issued2002-07-02de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-AC11-Ede
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-135
dc.description.abstractDie Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren ("insulin-like growth factors", IGFs) stimulieren Wachstum und Differenzierung verschiedener Zelltypen. Die Verfügbarkeit der IGFs und ihre Interaktion mit spezifischen IGF- Zelloberflächenrezeptoren werden von sechs strukturell ähnlichen IGF-Bindungsproteinen ("IGF-binding proteins", IGFBPs) moduliert. Unter den IGFBPs hat IGFBP-6 die höchste Bindungsaffinität für IGF II. Die begrenzte Proteolyse von IGFBPs durch spezifische Proteasen verringert die Affinität der IGFBPs für IGFs, was in einem höheren Gehalt an freien IGFs resultiert.Diese Studie ist der erste Bericht über die Sekretion und Sortierung von IGFBPs und IGFBP-Proteasen in der polarisierten Madin-Darby canine kidney (MDCK) Zelllinie. Die Daten ergaben, dass MDCK-Zellen verschiedene neutrale Proteasen sezernieren, die IGFBP-2 bis -5 in Fragmente definierter Größe spalten. IGFBP-6, das wichtigste sequestrierende Bindungsprotein für IGF II, wird unter transienter Bildung von Fragmenten komplett abgebaut. Die IGFBP-6 Fragmente zeigten selbst nach geringfügiger proteolytischer Spaltung keine Affinität für IGF II, was die Bedeutung der Proteolyse von IGFBP-6 für die Aufrechterhaltung der Konzentration an freiem IGF II deutlich macht. Das Proteaseinhibitorprofil und die partielle Reinigung von IGFBP-6 Proteasen von Medien der MDCK-Zellen zeigten, dass IGFBP-6 von zwei verschiedenen Proteasen gespalten wird - eine Serin- und eine Disintegrinmetalloprotease (ADAM). Polypeptide in partiell gereinigten, Metalloprotease-haltigen Fraktionen kreuzreagierten mit Antikörpern gegen konservierte Domänen von ADAM 12 S in Western immunoblots. Diese Daten lassen vermuten, dass die IGFBP-6 Metalloprotease zu Familie der ADAM/ADAMTS gehört.MDCK-Zellen sezernieren IGFBP-4 und -6 Proteasen bevorzugt zur basolateralen Seite, während IGFBPs als Resultat spezifischer intrazellulärer Sortierungsprozesse hauptsächlich von der apikalen Seite abgegeben werden. MDCK-Zellen, die mit Maus (m)-IGFBP-6 cDNA stabil transfiziert wurden, zeigten ebenfalls eine bevorzugte apikale Sekretion von mIGFBP-6. Bei der strukturellen Charakterisierung von mIGFBP-6 aus überexprimierenden MDCK-Zellen, konnte eine Vielfalt von posttranslationalen Modifikationen (O-Glycosylierung, Phosphorylierung und Sulfatierung) nachgewiesen werden, deren physiologische Bedeutung jedoch noch unklar ist. Die Substitution der putativen O-Glycosylierungsstelle von mIGFBP-6 durch einen Alaninrest führte zu einer schnelleren elektrophoretischen Mobilität und zu marginalen Veränderungen der polarisierten Sekretion des Proteins, was zeigte, dass die O-Glycosylierung nicht als Signalstruktur für die polarisierte Sekretion von IGFBP-6 dient. Die Überexpression von mIGFBP-6 inhibierte das Wachstum von MDCK-Zellen vermutlich durch die Sequestrierung des endogenen IGF II und unterdrückt die Migration von MDCK-Zellen.Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die komplexe Regulierung der IGF-Aktivitäten in MDCK-Zellen IGFBPs und IGFBP-Proteasen beinhaltet. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass mIGFBP-6 in der Lage ist, wichtige biologische Prozesse wie Wachstum und Migration zu modulieren. Posstranslationale Modifikationen von IGFBP-6, wie z.B. O-Glycosylierung, Phosphorylierung und Sulfatierung, tragen zur hohen molekularen Heterogenität des Proteins bei und könnten für die Aufrechterhaltung seiner physiologischen Funktionen, polarisierte Sortierung, proteolytische Stabilität und Affinität für IGF II bedeutsam sein. Die Daten belegen, dass zusätzlich zur Präsenz von IGF-Rezeptoren in der basolateralen Membran von MDCK-Zellen, die Sortierung von zumindest IGFBPs und IGFBP-Proteasen zu distinkten Seiten, zur Komplexität und Feinregulation der Funktion von Epithelzellen beiträgt.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyrdiss.htmde
dc.titleInsulin-Like Growth Factor Binding Protein-6: Posttranslational modifications and sorting in polarized MDCK cellsde
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedInsulin-ähnlicher Wachstumsfaktor Bindungsprotein 6: Posttranslationale Modifikationen und Sortierung in polarisierten MDCK Zellende
dc.contributor.refereeFigura, Kurt von Prof. Dr. Dr. h.c.de
dc.date.examination2001-10-30de
dc.subject.dnb570 Biowissenschaften, Biologiede
dc.description.abstractengThe insulin-like growth factors (IGFs) promote proliferation, and differentiation of a variety of cell types. The IGF availability and interactions with specific cell surface IGF-receptors are modulated by six structurally related IGF-binding proteins (IGFBPs). Among the IGFBPs, IGFBP-6 has the highest binding affinity for IGF II. Limited proteolysis of IGFBPs by specific proteases decreases the affinity of IGFBPs for IGFs, thus maintaining high levels of free IGFs.This study represents the first report on the secretion and sorting of IGFBPs and IGFBP-proteases in polarized epithelial Madin-Darby canine kidney (MDCK) cell line. It was found that MDCK cells secrete a variety of neutral proteases cleaving IGFBP-2 to -5 into fragments of defined sizes. IGFBP-6, the main sequestratrating binding protein of IGF II, was completely degraded with transient fragment formation. The IGFBP-6 fragments, even after a minor proteolytic cleavage, displayed no affinity for IGF II, demonstrating the importance of the IGFBP-6 proteolysis for maintainance of free IGF II levels. Protease inhibitor profile and partial purification of IGFBP-6 proteases from media of MDCK cells showed that IGFBP-6 is degraded by two different proteases - a serine and a disintegrin metalloprotease (ADAM). Polypeptides in partially purified metalloprotease-containing fractions cross-reacted with antibodies against conserved domains of ADAM 12 S in Western blots. These data suggest that the IGFBP-6 metalloprotease may belong to the ADAM/ADAMTS family.MDCK cells secreted IGFBP-4 and -6 proteases preferentially from the basolateral side, whereas the IGFBPs were secreted mainly from the apical side as a result of specific intracellular sorting processes. MDCK cells stably transfected with mouse IGFBP-6 cDNA, demonstrated a preferential apical secretion of mIGFBP-6. Structural characterization of mIGFBP-6 overexpressed in MDCK cells revealed the presence of a variety of posttranslational modifications (O-glycosylation, phosphorylation and sulfation), which physiological functions are unclear. Substitution of a putative O-glycosylation site of mIGFBP-6 with an alanine residue resulted in a higher electrophoretic mobility and in marginal changes of the polarized secretion of the protein. Overexpression of mIGFBP-6 inhibited the proliferation of MDCK cells presumably by sequestration of the endogenous IGF II, and suppressed the migration of MDCK cells.The present study indicates that the complex regulation of IGF actions in MDCK cells involve IGFBPs and IGFBP-proteases. The results suggest that mIGFBP-6 is capable of modulating important physiological processes like proliferation and migration. The role of the posttranslational modifications of mIGFBP-6, such as O-glycosylation, phosphorylation, or sulfation, for the maintainance of its physiological functions, polarized sorting, proteolytic stability, and affinity to IGF II remains to be investigated.de
dc.contributor.coRefereeGottschalk, Gerhard Prof. Dr.de
dc.subject.topicMathematics and Computer Sciencede
dc.subject.gerIGFBP-6de
dc.subject.gerProteolysede
dc.subject.gerMDCK Zellende
dc.subject.gerProteinsortierungde
dc.subject.gerposttranslationale Modifikationende
dc.subject.engIGFBP-6de
dc.subject.engproteolysisde
dc.subject.engMDCK cellsde
dc.subject.engprotein sortingde
dc.subject.engposttranslational modificationsde
dc.subject.bk42.13de
dc.subject.bk42.15de
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1233-3de
dc.identifier.purlwebdoc-1233de
dc.affiliation.instituteBiologische Fakultät inkl. Psychologiede
dc.subject.gokfullWHF 800: Permeabilität, inter- und intrazellulärer Transport {Cytologie}de
dc.subject.gokfullWF 000: Molekularbiologie, Gentechnologiede
dc.identifier.ppn356025365


Dateien

Thumbnail

Das Dokument erscheint in:

Zur Kurzanzeige