Identification and Functional Characterization of Novel Genes Involved in Primary Neurogenesis in Xenopus laevis
Characterization of Novel Genes Involved in Neurogenesis in Xenopus
by Jacob Souopgui
Date of Examination:2002-06-20
Date of issue:2002-07-16
Advisor:Prof. Dr. Tomas Pieler
Referee:Prof. Dr. Tomas Pieler
Referee:Prof. Dr. Sigrid Hoyer-Fender
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Size:27.7Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
The South African claw-toed frog, Xenopus laevis, is a good model to study neurogenesis in vertebrates. Early on, at the open neural plate stage, the territory of primary neurons is nicely defined by a set of neural genes expressed in a typical pattern in the form of stripes which define three bilateral groups of cells giving rise to motor neurons, interneurons, and sensory neurons, respectively. One subset comprises genes whose expression pattern mimics that of N-tubulin, a neuronal differentiation marker. This subset has been refered to as N-tubulin synexpression group, thanks to the observation that members of this group are involved in the differentiation of primary neurons. Another subset, designated Delta synexpression group, includes genes whose expression pattern is similar to that of X-Delta-1. Members of this group regulate the local cell-cell interactions in the context of primary neurogenesis known as lateral inhibition. Overall, these patterns of expression are a valuable criterion to search for novel genes involved in primary neurogenesis. We have analysed 500 clones from a Xenopus tailbud stage head cDNA library by use of a systematic expression pattern screen. From the panel of neurally expressed genes, five were expressed in form of stripes. Three of these genes have not been described in Xenopus. These genes are XPak3, a serine/threonine protein kinase, and X-Mxi1, a basic helix-loop-helix leucine zipper protein, both belonging to the N-tubulin synexpression group, and XSeb4, a RRM-type RNA binding protein, belonging to the X-Delta-1 synexpression group. Based on the fact that XPak3 and XSeb4 define regulatory molecules with unknown function in neurogenesis, their functional characterization was carried out. By embryo microinjection experiments, XPak3 and XSeb4 were found to be transcriptionally activated by the proneural factor X-Neurogenin related-1 (X-Ngnr-1) and repressed by lateral inhibition. Comparative expression pattern analysis showed that XPak3 but not XPak1 or XPak2 is a neuronally expressed XPak isoform. Interestingly, overexpression of a constitutively active form of XPak3, XPak3-myr, induced premature neuronal differentiation, a phenotype correlating with the induction of cell cycle arrest. Conversely, XPak3 loss-of-function, generated by using a morpholino antisense oligonucleotide, blocked the formation of primary neurons and induced increased cell proliferation. This inhibition of neurogenesis was rescued by coinjection of XPak3-myr. In conclusion, we propose that XPak3 is induced by neurogenin to inhibit the mitosis of neuronally programmed cells and thereby allowing for their differentiation. Ectopic expression of high concentrations (>150 pg) of XSeb4 inhibits the formation of primary neurons. Unexpectedly, the suppression of XSeb4 expression, using morpholino antisense oligonucleotide, also led to inhibition of neurogenesis. Microinjection of low concentrations of XSeb4 mRNA showed no effect on the expression of N-tubulin. These contradictory findings require further systematic investigations.
Keywords: primary neurogenesis; expression pattern screen; novel genes; Xpak3; cell cycle control; XSeb4; neurons differentiation; Xenopus laevis
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Der Südafrikanische Krallenfrosch Xenopus laevis ist ein gutes System für das Studium der Neurogenese in Vertebraten. Bereits früh, im offenen Neuralplattenstadium, wird das Gebiet der primären Neuronen durch eine Gruppe von neuralen Genen definiert, die in einem typischen Muster in Form von Streifen exprimiert werden und die drei bilaterale Zellgruppen definieren, aus denen jeweils Motorneuronen, Interneuronen und sensorische Neuronen hervorgehen. Eine Untergruppe enthält Gene, deren Expressionsmuster dem von N-tubulin, einem neuronalen Differenzierungsmarker, entspricht. Diese Untergruppe wird aufgrund der Beobachtung, dass Mitglieder dieser Gruppe bei der Differenzierung von primären Neuronen eine Funktion besitzen, als N-tubulin Synexpressionsgruppe bezeichnet. Eine andere Untergruppe, die als Delta Synexpressionsgruppe bezeichnet wird, beinhaltet Gene, deren Expressionsmuster dem von X-Delta-1 ähnelt. Mitglieder dieser Gruppe regulieren die lokalen Zell-Zell-Interaktionen, im Zusammenhang mit der primären Neurogenese bekannt als laterale Hemmung. Insgesamt sind solche Expressionsmuster ein wertvolles Kriterium für die Suche nach neuen Genen, die bei der primären Neurogenese eine Funktion besitzen. Wir haben 500 Klone aus einer Xenopus Schwanzknospenstadium Kopf cDNA Bank durch Verwendung einer systematischen Expressionsmusteranalyse untersucht. Aus der Fülle der neural exprimierten Gene werden fünf in Form von Streifen exprimiert. Drei dieser Gene sind in Xenopus bisher nicht beschrieben worden. Diese beeinhalten XPak3, eine Serin/Threonin Proteinkinase, und X-Mxi1, ein basisches Helix-Loop-Helix Leucin Zipper Protein, die beide zur N-tubulin Synexpressionsgruppe gehören, sowie XSeb4, ein RRM-Typ RNA bindendes Protein, das zur Delta Synexpressionsgruppe gehört. Basierend auf der Tatsache, dass XPak3 und XSeb4 regulatorische Moleküle mit unbekannter Funktion bei der Neurogenese definieren, wurde ihre funktionelle Charakterisierung durchgeführt. Durch Mikroinjektionsexperimente in Embryonen wurde gefunden, dass XPak3 und XSeb4 auf Transkriptionsebene durch den proneuralen Faktor X-Neurogenin related-1 (X-Ngnr-1) aktiviert und durch laterale Hemmung reprimiert wurden. Eine vergleichende Expressionsmusteranalyse zeigte, dass XPak3, aber nicht XPak1 und XPak2, eine neuronal exprimierte XPak Isoform ist. Interessanterweise induzierte die Überexpression einer konstitutiv aktiven Form von XPak3, XPak3-myr, vorzeitige neuronale Differenzierung, ein Phänotyp, der mit der Induktion von Zellzyklusarretierung korreliert. Umgekehrt blockierte der XPak3 Funktionsverlust, der durch Verwendung eines Morpholino-antisense-Oligonukleotids erzeugt wurde, die Bildung von primären Neuronen und induzierte eine gesteigerte Zellproliferation. Diese Hemmung der Neurogenese wurde durch Koinjektion von XPak3-myr wieder aufgehoben. Schlussfolgernd schlagen wir vor, dass XPak3 von Neurogenin induziert wird, um die Mitose neuronal programmierter Zellen zu inhibieren und so deren Differenzierung zu erlauben. Ektopische Expression hoher Konzentrationen (>150 pg) von XSeb4 hemmt die Bildung primärer Neuronen. Unerwarteterweise führte die Unterdrückung der XSeb4 Expression durch die Verwendung eines Morpholino-antisense-Oligonukleotids ebenfalls zur Hemmung der Neurogenese. Die Mikroinjektion niedriger Konzentrationen von XSeb4 mRNA zeigte keinen Effekt auf die Expression von N-tubulin. Diese widersprüchlichen Befunde erfordern weitere systematische Untersuchungen.
Schlagwörter: Neurogenese; primären Neuronen; neuen Genen; Expressionsmusteranalyse; XPak3; Zellproliferation; XSeb4; neuronal Differenzierung