Identification and Functional Characterization of Novel Genes Involved in Primary Neurogenesis in Xenopus laevis

Abstract

Der Südafrikanische Krallenfrosch Xenopus laevis ist ein gutes System für das Studium der Neurogenese in Vertebraten. Bereits früh, im offenen Neuralplattenstadium, wird das Gebiet der primären Neuronen durch eine Gruppe von neuralen Genen definiert, die in einem typischen Muster in Form von Streifen exprimiert werden und die drei bilaterale Zellgruppen definieren, aus denen jeweils Motorneuronen, Interneuronen und sensorische Neuronen hervorgehen. Eine Untergruppe enthält Gene, deren Expressionsmuster dem von N-tubulin, einem neuronalen Differenzierungsmarker, entspricht. Diese Untergruppe wird aufgrund der Beobachtung, dass Mitglieder dieser Gruppe bei der Differenzierung von primären Neuronen eine Funktion besitzen, als N-tubulin Synexpressionsgruppe bezeichnet. Eine andere Untergruppe, die als Delta Synexpressionsgruppe bezeichnet wird, beinhaltet Gene, deren Expressionsmuster dem von X-Delta-1 ähnelt. Mitglieder dieser Gruppe regulieren die lokalen Zell-Zell-Interaktionen, im Zusammenhang mit der primären Neurogenese bekannt als laterale Hemmung. Insgesamt sind solche Expressionsmuster ein wertvolles Kriterium für die Suche nach neuen Genen, die bei der primären Neurogenese eine Funktion besitzen. Wir haben 500 Klone aus einer Xenopus Schwanzknospenstadium Kopf cDNA Bank durch Verwendung einer systematischen Expressionsmusteranalyse untersucht. Aus der Fülle der neural exprimierten Gene werden fünf in Form von Streifen exprimiert. Drei dieser Gene sind in Xenopus bisher nicht beschrieben worden. Diese beeinhalten XPak3, eine Serin/Threonin Proteinkinase, und X-Mxi1, ein basisches Helix-Loop-Helix Leucin Zipper Protein, die beide zur N-tubulin Synexpressionsgruppe gehören, sowie XSeb4, ein RRM-Typ RNA bindendes Protein, das zur Delta Synexpressionsgruppe gehört. Basierend auf der Tatsache, dass XPak3 und XSeb4 regulatorische Moleküle mit unbekannter Funktion bei der Neurogenese definieren, wurde ihre funktionelle Charakterisierung durchgeführt. Durch Mikroinjektionsexperimente in Embryonen wurde gefunden, dass XPak3 und XSeb4 auf Transkriptionsebene durch den proneuralen Faktor X-Neurogenin related-1 (X-Ngnr-1) aktiviert und durch laterale Hemmung reprimiert wurden. Eine vergleichende Expressionsmusteranalyse zeigte, dass XPak3, aber nicht XPak1 und XPak2, eine neuronal exprimierte XPak Isoform ist. Interessanterweise induzierte die Überexpression einer konstitutiv aktiven Form von XPak3, XPak3-myr, vorzeitige neuronale Differenzierung, ein Phänotyp, der mit der Induktion von Zellzyklusarretierung korreliert. Umgekehrt blockierte der XPak3 Funktionsverlust, der durch Verwendung eines Morpholino-antisense-Oligonukleotids erzeugt wurde, die Bildung von primären Neuronen und induzierte eine gesteigerte Zellproliferation. Diese Hemmung der Neurogenese wurde durch Koinjektion von XPak3-myr wieder aufgehoben. Schlussfolgernd schlagen wir vor, dass XPak3 von Neurogenin induziert wird, um die Mitose neuronal programmierter Zellen zu inhibieren und so deren Differenzierung zu erlauben. Ektopische Expression hoher Konzentrationen (>150 pg) von XSeb4 hemmt die Bildung primärer Neuronen. Unerwarteterweise führte die Unterdrückung der XSeb4 Expression durch die Verwendung eines Morpholino-antisense-Oligonukleotids ebenfalls zur Hemmung der Neurogenese. Die Mikroinjektion niedriger Konzentrationen von XSeb4 mRNA zeigte keinen Effekt auf die Expression von N-tubulin. Diese widersprüchlichen Befunde erfordern weitere systematische Untersuchungen.