Gezielte Modifikation sowie Analyse der Bindungseigenschaften des Histidin Bindeproteins aus Escherichia coli und des GCN4 Leucinzippers aus Saccharomyces cerevisiae
Modification and analysis of the binding properties of the histidine-binding protein from Escherichia coli and the GCN4-Leucine zipper from Saccharomyces cerevisiae
von Julia Wittmann
Datum der mündl. Prüfung:2002-10-31
Erschienen:2002-11-27
Betreuer:Prof. Dr. Hans-Joachim Fritz
Gutachter:PD Dr. Harald Kolmar
Gutachter:Prof. Dr. Frank Mayer
Gutachter:Prof. Dr. Dietrich Gradmann
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Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
The histidine-binding protein (HisJ) belongs to the super-family of soluble periplasmic receptor proteins in gram-negative bacteria like Escherichia coli. HisJ takes part in transloctation of histidine into the cytoplasm and displays an affinity for its ligand in the nanomolar range. Exchange of a leucine residue at position 52 with a phenyalanine results in drastic increase of affinity of HisJ for histidine, as well as arginine and lysine. Determination of the binding constant for the respective D enantiomers proves that this increase of affinity is due to strong hydrophobic interactions of the phenyalanine residue with the sidechain atoms of the ligands. Investigation of the interaction of HisJ with two histidine derivatives allows prediction of how the D-enantiomers are orientated within the binding pocket. It was also shown that the alkaline amino acids are capable of stabilizing HisJ, but the extent of stabilisation does not correlate with the affinity of the protein fo! r the respective ligand. GCN4, a general transcription activator in yeast, is known to form stable homodimers via hydrophobic interaction of leucine residues at every seventh position. Exchange of one or two of these leucine residues with either glycine or alanine results in drastic decrease of homodimer formation. Using the ToxR-system for molecular interactions, a library of low molecular weight substances was screened for a compound that is capable of recovering GCN?s ability to form stable homodimers.
Keywords: Receptor-ligand interaction; protein-protein interaction; direct mutagenesis; protein stbility
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Das Histidin-Bindeprotein (HisJ) gehört zur Familie der löslichen periplasmatischen Rezeptorproteine gramnegativer Bakterien wie Escherichia coli. HisJ ist am Transport von Histidin ins Zytoplasma beteiligt und besitzt für seinen Liganden eine Affinität im nanomolaren Bereich. Durch Austausch eines Leucinrestes an Position 52 gegen ein Phenylalanin konnte die Affinität des HisJ für Histidin, Arginin und Lysin deutlich erhöht werden. Durch Bestimmung der Bindungskonstanten für die jeweiligen D Enantiomere konnte gezeigt werden, dass diese Steigerung der Affinität auf verstärkten hydrophoben Wechselwirkungen des Phenylalanins mit den Seitenkettenatomen der Liganden beruht. Anhand von Untersuchungen der Wechselwirkung des HisJ mit zwei Histidinderivaten konnten Rückschlüsse auf die Orietierung der D Enantiomere in der Bindungstasche gezogen werden. Es wurde außerdem gezeigt, dass die akalischen Aminosäuren in der Lage sind, HisJ zu stabilisieren, allerdings korreliert das Ausma! ß der Stabilisierung nicht mit der Affinität der Proteins für den jeweiligen Liganden. GCN4, ein allgemeiner Transkriptionsaktivator aus der Hefe, bildet stabile Homodimere durch hydrophobe Wechselwirkungen zwischen Leucinresten an jeder siebten Position. Austausch eines oder zweier dieser Leucinreste gegen ein Glycin bzw. ein Alanin resultiert in drastischem Einbruch der Dimerisierungstendenz des GCN4. Unter Verwendung des ToxR-System zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen wurde eine Bibliothek niedermolekularer Substanzen auf eine Verbindung durchmustert, die in der Lage ist, die Fähigkeit des GCN4 zur Ausbildung stabiler Homodimere wiederherzustellen.
Schlagwörter: Rezeptor-Liganden-Wechselwirkung; Protein-Protein-Wechselwirkun; direkte Mutagenese; Proteinstabilität