Strukturelle und funktionelle Untersuchungen zum m3G-Cap-vermittelten Kernimport spleißosomaler U snRNPs durch Snurportin1
Structural basis for mm3G-Cap-mediated nuclear import of spliceosomal UsnRNPs by snurportin1
by Anja Strasser
Date of Examination:2005-01-27
Date of issue:2005-02-01
Advisor:Prof. Dr. Ralf Ficner
Referee:PD Dr. Stefan Irniger
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
During snRNP biogenesis the snRNAs are exported into the cytoplasm, where the assembly with the common Sm proteins occurs and the 5´cap nucleotide is modified from an 7-methyl-guanosine (m7G-) to a 2,2,7-trimethyl-guanosine (m3G-) cap. The hypermethylated m3G-cap represents one of the nuclear localisation signals of the snRNPs U1, U2, U4 and U5. As an import adaptor snurportin1 bridges the interaction between the m3G-cap containing snRNPs and the nuclear import receptor importin beta, which mediates the passage through the nuclear pore complex. Snurportin1 contains a N-terminal importin beta-binding (IBB) domain and a C-terminal m3G-cap-binding region, which shows no similarity to other import factors.This work presents the crystal structure of the m3G-cap binding domain of SPN1 in complex with an m3GpppG cap dinucleotide. SPN1 binds both of the bases of the dinucleotide in a stacked conformation between Trp 276 and Leu 104. The methylated, positively charged guanine base interacts with the pi-electron systems of Trp 276 and the nonmethylated base. This kind of interaction is called cation-pi-interaction. Trp 107 is located perpendicular to the stack and forms van-der-Waals contacts to the methyl groups on N2. Stacking of both bases and an aromatic residue perpendicular to the stack were not observed in other m7G-cap binding proteins. These proteins only bind the methylated cap base between two aromatic side chains in a stacked conformation. For the functional characterisation of cap-binding by SPN1, dissociation constants for mono- and trimethylated caps were defined and the binding affinities of tryptophane mutants for m3GpppG were investigated by fluorescence assays and their import activity was quantified by an in vitro nuclear import assay.The presented crystal structure of SPN1 in complex with m3GpppG shows a novel cap-binding mode in contrast to m7G-cap-binding proteins structurally investigated (CBC, eIF4E and VP39). Furthermore differences in cap-binding affinities of SPN1 for mono- and trimethylated cap-oligonucleotides were demonstrated and binding contributions of the interacting tryptophane residues were quantified.
Keywords: snurportin1; snRNPs; spliceosomal subunits; cap; cation-pi-interactions
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Während der Biogenese spleißosomaler Untereinheiten (U snRNPs) wird die U snRNA nach der Transkription ins Zytoplasma exportiert, wo die Zusammenlagerung mit sieben Sm-Proteinen erfolgt und nachfolgend das 7-Methyl-Guanosin (m7G)-Cap zu einem 2,2,7-Trimethyl-Guanosin (m3G)-Cap umgewandelt wird. Das hypermethylierte m3G-Cap stellt ein Kernimportsignal der snRNPs U1, U2, U4 und U5 dar. Snurportin1 (SPN1) vermittelt als Importadaptor die Interaktion zwischen den m3G-Cap-tragenden snRNPs und dem Kernimportrezeptor Importin beta, der die Kernporenpassage mediiert. SPN1 besteht aus einer N-terminalen Importin beta-bindenden (IBB)-Domäne und einer C-terminalen m3G-Cap-bindenden Domäne, die keinerlei Sequenzähnlichkeit zu anderen Proteinen aufweist.In der vorliegenden Arbeit wurde die Struktur der m3G-Cap-bindende Domäne von SPN1 im Komplex mit m3GpppG aufgeklärt. SPN1 bindet das hypermethylierte m3GpppG-Cap mit gestapelten Basen zwischen Trp 276 und Leu 104. Diese Form der Wechselwirkung der positiv geladenen Cap-Base mit den pi-Elektronensystemen des benachbartenTrp 276 und der unmethylierten snRNA-Base nennt sich Kationen-pi-Interaktion. Trp 107 liegt senkrecht über dem Basenstapel und geht zusätzlich van-der-Waals Interaktionen mit den Methylgruppen an Position N2 der Cap-Base ein. In allen strukturell analysierten m7G-Cap-bindenden Proteinen wird lediglich die methylierte Cap-Base zwischen zwei aromatischen Aminosäureresten gestapelt und ein aromatischer Rest senkrecht zum Basenstapel fehlt. Zur funktionellen Analyse der Cap-Bindung durch SPN1 wurden sowohl Dissoziationskonstanten mono- und trimethylierter Cap-Analoga bestimmt, als auch das Bindungsverhalten von Tryptophan-Mutanten (W276A und W107A) über Fluoreszenzbindungsassays und deren Importaktivität über einen in vitro Kernimportassay untersucht.Durch die strukturelle Analyse der m3G-Cap-bindenden Domäne von SPN1 konnte eine neue Form der Cap-Bindung im Vergleich zu strukturell untersuchten m7G-Cap-bindenden Proteinen (CBC, eIF4E und VP39) gezeigt werden. Des Weiteren wurden Unterschiede in den Bindungsaffinitäten von SPN1 zu mono- und trimethylierten Cap-Analoga gefunden und der Bindungsbeitrag der mit dem m3GpppG-Cap interagierenden Tryptophan-Reste von SPN1 wurde quantifiziert.
Schlagwörter: Snurportin1; snRNPs; spleißosomale Untereinheiten; Cap; Kationen-pi-Interaktion