Strukturelle und funktionelle Untersuchungen zum m3G-Cap-vermittelten Kernimport spleißosomaler U snRNPs durch Snurportin1

Abstract

Während der Biogenese spleißosomaler Untereinheiten (U snRNPs) wird die U snRNA nach der Transkription ins Zytoplasma exportiert, wo die Zusammenlagerung mit sieben Sm-Proteinen erfolgt und nachfolgend das 7-Methyl-Guanosin (m7G)-Cap zu einem 2,2,7-Trimethyl-Guanosin (m3G)-Cap umgewandelt wird. Das hypermethylierte m3G-Cap stellt ein Kernimportsignal der snRNPs U1, U2, U4 und U5 dar. Snurportin1 (SPN1) vermittelt als Importadaptor die Interaktion zwischen den m3G-Cap-tragenden snRNPs und dem Kernimportrezeptor Importin beta, der die Kernporenpassage mediiert. SPN1 besteht aus einer N-terminalen Importin beta-bindenden (IBB)-Domäne und einer C-terminalen m3G-Cap-bindenden Domäne, die keinerlei Sequenzähnlichkeit zu anderen Proteinen aufweist.In der vorliegenden Arbeit wurde die Struktur der m3G-Cap-bindende Domäne von SPN1 im Komplex mit m3GpppG aufgeklärt. SPN1 bindet das hypermethylierte m3GpppG-Cap mit gestapelten Basen zwischen Trp 276 und Leu 104. Diese Form der Wechselwirkung der positiv geladenen Cap-Base mit den pi-Elektronensystemen des benachbartenTrp 276 und der unmethylierten snRNA-Base nennt sich Kationen-pi-Interaktion. Trp 107 liegt senkrecht über dem Basenstapel und geht zusätzlich van-der-Waals Interaktionen mit den Methylgruppen an Position N2 der Cap-Base ein. In allen strukturell analysierten m7G-Cap-bindenden Proteinen wird lediglich die methylierte Cap-Base zwischen zwei aromatischen Aminosäureresten gestapelt und ein aromatischer Rest senkrecht zum Basenstapel fehlt. Zur funktionellen Analyse der Cap-Bindung durch SPN1 wurden sowohl Dissoziationskonstanten mono- und trimethylierter Cap-Analoga bestimmt, als auch das Bindungsverhalten von Tryptophan-Mutanten (W276A und W107A) über Fluoreszenzbindungsassays und deren Importaktivität über einen in vitro Kernimportassay untersucht.Durch die strukturelle Analyse der m3G-Cap-bindenden Domäne von SPN1 konnte eine neue Form der Cap-Bindung im Vergleich zu strukturell untersuchten m7G-Cap-bindenden Proteinen (CBC, eIF4E und VP39) gezeigt werden. Des Weiteren wurden Unterschiede in den Bindungsaffinitäten von SPN1 zu mono- und trimethylierten Cap-Analoga gefunden und der Bindungsbeitrag der mit dem m3GpppG-Cap interagierenden Tryptophan-Reste von SPN1 wurde quantifiziert.