Subcellular and functional analyses of two small heat shock proteins and protein kinases from peroxisomes of Arabidopsis thaliana L.
Subzelluläre und funktionelle Analysen von zwei kleinen Hitzeschockproteinen und Proteinkinasen von Peroxisomen aus Arabidopsis thaliana L.
by Changle Ma
Date of Examination:2006-01-19
Date of issue:2006-08-18
Advisor:Dr. Sigrun Reumann
Referee:Prof. Dr. Hans-Walter Heldt
Referee:Prof. Dr. Ivo Feussner
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
To gain first insights into mechanisms of polypeptide refolding and post-translational regulation of matrix enzymes from plant peroxisomes, the Arabidopsis genome was screened for annotated chaperones and protein kinases that carried a putative peroxisome targeting signal 1 or 2 (PTS1/2). Two small heat-shock proteins (sHsps) and seven protein kinases were identified. Regarding the sHsps, homologs of which had not been localized to the matrix of peroxisomes in any organism, both putative Arabidopsis sHsps (AtHsp15.7 and AtAcd31.2) were shown to be targeted to the peroxisome matrix as demonstrated by double labelling experiments using fusion proteins with enhanced yellow fluorescent protein (EYFP). The peroxisomal localization of AtHsp15.7 was further confirmed by immunochemical detection of the protein in a fraction of highly enriched leaf peroxisomes isolated from an Arabidopsis transgenic line overexpressing 35S:AtHSP15.7. The chaperone activity of AtHsp15.7 and AtAcd31.2 was confirmed by functional complemention of Saccharomyces cerevisiae mutants deficient in the cytosolic homologs ScHsp42 or ScHsp26 with the Arabidopsis proteins lacking the PTS. According to expression studies by RT-PCR, AtAcd31.2 showed an atypical constitutive expression pattern, whereas AtHsp15.7 was strongly induced by heat and oxidative stress. Two Arabidopsis T-DNA insertion mutants and a double mutant of these two sHsps were identified and phenotypically characterized. Regarding the seven Arabidopsis putative peroxisomal protein kinases (PPPKs), several cDNAs were cloned by RT-PCR and heterologously expressed in yeast and plant cells as fluorescent fusion proteins. While most fusion proteins were targeted to peroxisomes in S. cerevisiae , they generally remained cytosolic in Allium cepa. The affinity between plant Pex5p and the putative PTS1 was investigated independent of polypeptide folding by fusing the predicted peroxisome targeting domains of PPPKs comprising about 10-amino acid to EYFP. The C-terminal domain of four PPPKs were demonstrated to be sufficient to direct EYFP to peroxisomes in Allium cepa, indicating that these protein kinases are able to target transiently to plant peroxisomes in vivo under specific yet unknown environmental conditions. Other fusion proteins remained cytosolic, surprisingly including PPPK1 with the prototypical PTS1 peptide SKL>. Based on site-directed mutagenesis of the PTS1 targeting domains combined with in vivo targeting analysis, basic residues and acidic residues were characterized as essential targeting enhancing and inhibitory elements, respectively. For AtPPPK4, which represents one of three Arabidopsis homologs of the yeast protein kinase ATG1 with an important role in autophagy and pexophagy, yeast two hybrid assays revealed protein-protein interaction of a specific domain with the regulatory protein AtAtg13a.
Keywords: Chaperones; protein kinase; green fluorescent protein; peroxisome; oxidative stress; subcellular targeting signal
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Um neue Erkenntnisse über die Rolle von molekularen Chaperonen und eine mögliche post-translationale Regulation des Peroxisomen-Stoffwechsels zu gewinnen, wurde mit Hilfe einer in silico Analyse das Arabidopsis Proteom nach regulatorischen Proteinen durchsucht, welche eine mögliche Peroxisomen-Zielsteuerungssequenz 1 oder 2 (PTS) enthalten. Auf diese Weise konnten zwei kleine Hitzeschockproteine (sHsps - small heat shock proteins) und sieben Proteinkinasen identifiziert werden. Die kleinen Hitzeschockproteine (AtHsp15.7 und AtAcd31.2), deren Homologe noch in keinem Organismus in Peroxisomen nachgewiesen worden waren, wurden mit Hilfe von Doppelfluoreszenzmarkierung in Peroxisomen lokalisiert. Die Zielsteuerung zu Peroxisomen konnte für AtHsp15.7 zudem immunochemisch untermauert werden, indem das Protein in einer angereicherten Peroxisomenfraktionen von AtHsp15.7 überexprimierenden Arabidopsis Pflanzen nachgewiesen werden konnte. Die Chaperon-Aktivität der beiden sHsps wurde an Hand von Experimenten demonstriert, bei denen Hefemutanten der cytosolischen Homologe ScHsp42 und ScHsp26 funktionell komplementiert wurden. Wie durch RT-PCR gezeigt werden konnte, wird AtAcd31.2 konstitutiv exprimiert, während die Expression von AtHsp15.7 durch Hitze oder oxidativem Stress induziert wird. Zwei T-DNA-Insertionslinien der beiden sHsps wurden identifiziert, Doppelmutanten hergestellt und die physiologische Rolle anhand phenotypischer Analysen untersucht. Die vollständigen cDNAs mehrerer vermeintlicher peroxisomaler Protein-Kinasen (PPPKs) wurden mit Hilfe von RT-PCR kloniert und in Hefen oder Pflanzenzellen heterolog als GFP-(green fluorescent protein) Fusionsproteine exprimiert. In Hefezellen konnte eine Lokalisierung in Peroxisomen oder Peroxisomen-ähnlichen Strukturen nachgewiesen werden. In Allium cepa hingegen verblieben die Fusionsproteine überwiegend im Cytosol. Die Affinität zwischen dem pflanzlichen PTS1-Rezeptor AtPex5p und dem vermeintlichen PTS1 der Proteine wurde unabhängig von der Polypeptidfaltung analysiert, indem die aus ungefähr zehn Aminosäuren bestehenden C-terminalen Peroxisomen-Zielsteuerungssequenzen mit EYFP (enhanced yellow fluorescent protein) fusioniert wurde. Für vier Protein-Kinasen wurde gezeigt, dass die Proteine eine funktionelle Zielsteuerungsdomäne für pflanzliche Peroxisomen besitzen und höchstwahrscheinlich nach Transduktion eines bestimmten aber bislang unbekannten Signals oder Stimulus transient in die Peroxisomenmatrix gelenkt werden. Zu den Fusionsproteinen hingegen, die im Cytosol verblieben, gehörte überraschenderweise die Kinase mit dem prototypischen PTS1 SKL>. Anhand von gezielter Mutagenese ausgesuchter PTS-Domänen in Kombination mit subzellulären Lokalisierungsexperimenten konnte gezeigt werden, dass basische Aminosäuren eine Zielsteuerung zu Peroxisomen fördern, während saure Aminosäuren eine inhibierende Wirkung ausüben. Unter den vier PPPKs, welche eine funktionelle PTS1-Domäne besitzen, repräsentiert PPPK4 eines von drei Arabidopsis Proteinen, welche homolog zur Proteinkinase ATG1 von Hefen und Säugetieren sind. Die Proteinkinase ATG1 erfüllt in Hefe eine wichtige Rolle bei der Autophagie und der Pexophagie. In Hefe-2-Hybrid-Analysen konnte eine Interaktion von PPPK4 mit dem Arabidopsis-Homolog des in Hefen als regulatorische Untereinheit charakterisierten Proteins ATG13a nachgewiesen werden.
Schlagwörter: Chaperonen; Protein-Kinasen; GFP; Peroxisomen; oxidativem Stress; subzellulares zielendes Signal