Subcellular and functional analyses of two small heat shock proteins and protein kinases from peroxisomes of Arabidopsis thaliana L.

Abstract

Um neue Erkenntnisse über die Rolle von molekularen Chaperonen und eine mögliche post-translationale Regulation des Peroxisomen-Stoffwechsels zu gewinnen, wurde mit Hilfe einer in silico Analyse das Arabidopsis Proteom nach regulatorischen Proteinen durchsucht, welche eine mögliche Peroxisomen-Zielsteuerungssequenz 1 oder 2 (PTS) enthalten. Auf diese Weise konnten zwei kleine Hitzeschockproteine (sHsps - small heat shock proteins) und sieben Proteinkinasen identifiziert werden. Die kleinen Hitzeschockproteine (AtHsp15.7 und AtAcd31.2), deren Homologe noch in keinem Organismus in Peroxisomen nachgewiesen worden waren, wurden mit Hilfe von Doppelfluoreszenzmarkierung in Peroxisomen lokalisiert. Die Zielsteuerung zu Peroxisomen konnte für AtHsp15.7 zudem immunochemisch untermauert werden, indem das Protein in einer angereicherten Peroxisomenfraktionen von AtHsp15.7 überexprimierenden Arabidopsis Pflanzen nachgewiesen werden konnte. Die Chaperon-Aktivität der beiden sHsps wurde an Hand von Experimenten demonstriert, bei denen Hefemutanten der cytosolischen Homologe ScHsp42 und ScHsp26 funktionell komplementiert wurden. Wie durch RT-PCR gezeigt werden konnte, wird AtAcd31.2 konstitutiv exprimiert, während die Expression von AtHsp15.7 durch Hitze oder oxidativem Stress induziert wird. Zwei T-DNA-Insertionslinien der beiden sHsps wurden identifiziert, Doppelmutanten hergestellt und die physiologische Rolle anhand phenotypischer Analysen untersucht. Die vollständigen cDNAs mehrerer vermeintlicher peroxisomaler Protein-Kinasen (PPPKs) wurden mit Hilfe von RT-PCR kloniert und in Hefen oder Pflanzenzellen heterolog als GFP-(green fluorescent protein) Fusionsproteine exprimiert. In Hefezellen konnte eine Lokalisierung in Peroxisomen oder Peroxisomen-ähnlichen Strukturen nachgewiesen werden. In Allium cepa hingegen verblieben die Fusionsproteine überwiegend im Cytosol. Die Affinität zwischen dem pflanzlichen PTS1-Rezeptor AtPex5p und dem vermeintlichen PTS1 der Proteine wurde unabhängig von der Polypeptidfaltung analysiert, indem die aus ungefähr zehn Aminosäuren bestehenden C-terminalen Peroxisomen-Zielsteuerungssequenzen mit EYFP (enhanced yellow fluorescent protein) fusioniert wurde. Für vier Protein-Kinasen wurde gezeigt, dass die Proteine eine funktionelle Zielsteuerungsdomäne für pflanzliche Peroxisomen besitzen und höchstwahrscheinlich nach Transduktion eines bestimmten aber bislang unbekannten Signals oder Stimulus transient in die Peroxisomenmatrix gelenkt werden. Zu den Fusionsproteinen hingegen, die im Cytosol verblieben, gehörte überraschenderweise die Kinase mit dem prototypischen PTS1 SKL>. Anhand von gezielter Mutagenese ausgesuchter PTS-Domänen in Kombination mit subzellulären Lokalisierungsexperimenten konnte gezeigt werden, dass basische Aminosäuren eine Zielsteuerung zu Peroxisomen fördern, während saure Aminosäuren eine inhibierende Wirkung ausüben. Unter den vier PPPKs, welche eine funktionelle PTS1-Domäne besitzen, repräsentiert PPPK4 eines von drei Arabidopsis Proteinen, welche homolog zur Proteinkinase ATG1 von Hefen und Säugetieren sind. Die Proteinkinase ATG1 erfüllt in Hefe eine wichtige Rolle bei der Autophagie und der Pexophagie. In Hefe-2-Hybrid-Analysen konnte eine Interaktion von PPPK4 mit dem Arabidopsis-Homolog des in Hefen als regulatorische Untereinheit charakterisierten Proteins ATG13a nachgewiesen werden.