Untersuchungen zur Physiologie des Essigsäurebakteriums Gluconobacter oxydans 621H
Investigations on the Physiology of the Acetic Acid Bacterium Gluconobacter oxydans 621H
by Marc Hoffmeister
Date of Examination:2006-05-02
Date of issue:2006-08-22
Advisor:Dr. Armin Ehrenreich
Referee:Prof. Dr. Gerhard Gottschalk
Referee:Prof. Dr. Ruth Schmitz-Sreit
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-151
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Description:Dissertation
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Abstract
English
Gluconobacter oxydans 621H is a Gram-negative alpha-proteobacterium that belongs to the family Acetobacteriaceae. This strictly aerobic organism is adapted to growth in substrate-rich habitats like flowers or fruits, with optimal growth occurring at 25 to 30 °C at pH-values between 5.5 to 6.0. It is of great industrial relevance due to its ability to incompletely oxidize a broad range of organic substrates, mainly sugars or alcohols. These oxidizing capabilities are due to the presence of a large number of cytoplasmic and membrane-bound dehydrogenases in G. oxydans. The active-sites of the latter enzymes face the periplasmic space. Therefore, products can easily be purified out of the culture supernatants. In this work, transcriptome analyzes of G. oxydans 621H inoculated under various growth conditions were performed. A DNA-microarray was designed based on the whole genome-sequence, representing 94 % of all 2664 open reading frames (ORFs) of this organism. G. oxydans 621H was grown in continuous- or batch-cultures with varying C-sources, growth-rates, pH- or pO2-values to analyze the effect of these parameters on transcriptional regulation of all dehydrogenases or enzymes of central metabolic pathways. For selected dehydrogenase/reductase genes, the microarray data was verified by quantitative real-time RT-PCR. Using proteo-biochemical methods, an oxidation of hydroxylpiperidine-derivatives by G. oxydans 621H could be demonstrated. The corresponding enzyme was purified using FPLC and identified as a membrane-bound alcohol-dehydrogenase by nano-ESI-MS/MS. The results presented in this work allow first insights into genome-wide transcriptional regulations of G. oxydans 621H, and can serve as a basis for its optimization for biotechnological applications.
Keywords: Gluconobacter oxydans; Acetobacteriaceae; incomplete oxidation; microarray; transcriptional analyzes; continuous culture; chemostat;
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Gluconobacter oxydans 621H ist ein Gram-negatives alpha-Proteobakterium und zählt zur Familie der Acetobacteriaceae. Dieser strikt aerobe Organismus ist an substratreiche Habitate, z.B. Blütennektar oder Früchte, angepasst und wächst optimal bei 25 bis 30 °C und pH-Werten von 5,5 bis 6,0. Aufgrund der Fähigkeit zur unvollständigen Oxidation eines weiten Spektrums organischer Substrate, insbesondere von Zuckern oder Alkoholen, ist G. oxydans aber auch von großer biotechnologischer Bedeutung. Für diese Oxidationen besitzt G. oxydans eine Vielzahl cytoplasmatischer und membrangebundener Dehydrogenasen. Letztere ragen mit dem aktiven Zentrum in den periplasmatischen Raum hinein, sodass die entstehenden Reaktionsprodukte aus dem umgebenden Medium leicht aufzureinigen sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Transkriptom von G. oxydans 621H nach Wachstum unter verschiedenen Bedingungen untersucht. Hierzu wurde auf Basis der Genomsequenz ein Microarray konstruiert, das 94 % der 2664 Open Reading Frames (ORFs) abdeckt. G. oxydans 621H wurde in kontinuierlicher- und z.T. auch in batch-Kultur auf verschiedenen C-Quellen, mit unterschiedlichen Wachstumsraten, pH- oder pO2-Werten angezogen. Gesamt-RNA dieser Zellen diente zur Untersuchung der Transkriptionsregulation aller Dehydrogenasen, oder von Enzymen des zentralen Stoffwechsels. Anhand ausgewählter Dehydrogenase-/Reduktase-Gene wurden die Transkriptionsanalyse-Daten per quantitativer real-time RT PCR verifiziert. Proteinbiochemische Messungen zeigten erstmals die Fähigkeit von G. oxydans 621H zur Oxidation eines Hydroxypiperidin-Derivats. Die korrespondierende Dehydrogenase wurde mittels FPLC gereinigt und per nano-ESI-MS/MS als membrangebundene Alkohol-Dehydrogenase identifiziert. Die Ergebnisse dieser Arbeit geben einen Einblick in die genomweite Transkriptionsregulation von G. oxydans 621H und bieten somit eine Grundlage zur Optimierung des biotechnologischen Einsatzes dieses Bakteriums.
Schlagwörter: Gluconobacter oxydans; Acetobacteriaceae; unvollständige Oxidation; Microarray; Transkriptionsanalyse; kontinuierliche Kultur; Chemostat