Untersuchungen zur Expression, Funktion und Regulation ausgewählter Gene der Insulinfamilie

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden die Expression und Funktion von zwei neuen Mitgliedern der Insulinsuperfamilie, Insl5 und Insl6, untersucht. Mithilfe einer Northern-Blot-Analyse mit Gesamt-RNA aus unterschiedlichen Organen der adulten Maus konnte gezeigt werden, dass das Insl5-Gen sehr stark im Rektum der Maus exprimiert wird. Die Expression während der embryonalen Entwicklung konnte mittels Northern-Blot nicht nachgewiesen werden und wurde über eine RT-PCR-Analyse an Gesamt-RNA untersucht. Die ersten Transkripte sind in 11,5 Tage alten Embryonen nachweisbar. Für die funktionellen Untersuchungen von Insl5 in vivo, wurde ein Knockout Konstrukt hergestellt, in dem das zweite Exon deletiert wurde. Die Verteilung der Genotypen in der F2-Generation entsprach den Mendelschen Regeln, was darauf hindeutet, dass die Insl5-/--Mäuse keine Störung der Embryonalentwicklung aufweisen. Die homozygoten Insl5-defizienten Mäuse sind lebensfähig und zeigen keine phänotypischen Auffälligkeiten in Bezug auf Körpergröße, Gewicht oder Fertilität. Northern-Blot-Analysen konnten die Abwesenheit des Insl5-Transkripts in den -/- Mäusen bestätigen. Da die Inaktivierung von Insl5 zu keinem erkennbaren aberranten Phänotyp führte, kann auch angenommen werden, dass das Insl5-Gen bei der Maus keine wichtige Funktion besitzt. Das zweite untersuchte Gen war Insl6, das ebenfalls zur Insulinsuperfamilie gehört. Mithilfe von Northern-Blot-Analysen wurde gezeigt, dass das murine Insl6-Gen hauptsächlich im Testis exprimiert wird. Durch RT-PCR-Analyse konnte das Insl6-Transkript ab dem Tag 9,5 der embryonalen Entwicklung nachgewiesen werden. Die postnatale Insl6-Expression während der Testisentwicklung der Maus mittels Northern-Blot konnte deutlich ab Tag 20 gezeigt werden, was für eine Expression in diploiden und haploiden Keimzellen spricht. Die Expressionsanalyse des Insl6-Gens in den Testes mutanter Mäuse, deren Spermatogenese in verschiedenen Stadien arretiert ist, bestätigte diese Ergebnisse. Ein Insl6-Transkript war nur in Mauslinien detektierbar, deren Spermatogenese das Pachytänstadium erreicht. Für funktionelle Analysen wurde ein Konstrukt zur Generierung einer Insl6-Knockout Maus hergestellt. Durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen wurde das Exon 1 durch das Neomycin-Resistenzgen ersetzt. Es konnten nur niedrig-gradige Chimären (2-15% Chimärismus) erhalten werden. Bei der Verpaarung dieser Chimären wurde das rekombinante Allel nicht an die Nachkommen transmittiert. Eine männliche Chimäre mit 35% Chimärismus wurde mit Wildtypweibchen verpaart, es wurden keine Nachkommen gezeugt, es konnten auch keine Spermien im Uterus der Weibchen gefunden werden. Des weiteren wurden in dieser Arbeit drei verschiedene transgene Konstrukte hergestellt, in denen das humane Insulingen unter die Kontrolle des Leydigzell-spezifischen Insl3-Promotors gestellt wurde. Die generierten transgenen Mäuse sollten humanes Insulin im Testis produzieren. Durch Northern-Blot-Analyse konnte die Expression der transgenen Konstrukte im Testis gezeigt werden. Auf der Proteinebene wurde mithilfe des Fluoroimmunoassays und der RIA-Analyse das transgene humane Insulin nachgewiesen. Allerdings konnte das transgene Insulin weder Mäuse, die aufgrund einer Streptozotocin-Behandlung einen Diabetes entwickelten, noch Pax4-defiziente Mäuse retten. Es ist möglich, dass das produzierte Insulin in zu geringen Mengen und daher nicht ausreichend von den Leydigzellen sezerniert wird. Ob die Sekretionsmechanismen in Leydigzellen vergleichbar sind mit denen in β-Zellen des Pankreas, ist nicht geklärt. Daher sind weitere Experimente nötig, um zu prüfen, ob und inwieweit Leydigzellen als Ersatz für β-Zellen des Pankreas in Frage kommen können.