The tyrosine regulated DAHP synthase and the biosynthetic pathway of aromatic amino acids in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

3-Deoxy-D-arabino-Heptulosonat 7-Phosphat (DAHP) Synthasen (EC 2.5.1.54) katalysieren die erste Reaktion des Biosyntheseweges. Das aus der Glykolyse kommende Phosphoenolpyruvat (PEP) und das aus dem Pentosephosphatweg stammende Erythrose-4-Phosphat (E4P) werden zu DAHP kondensiert. In der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae liegen zwei DAHP Synthasen vor, die durch die Gene ARO3 und ARO4 kodiert werden und durch die Endprodukte Phenylalanin bzw. Tyrosin inhibiert werden können. Kristallstrukturen von der Phenylalanin regulierten DAHP Synthase aus Escherichia coli und dem Tyrosin inhibierbaren Isoenzym aus S. cerevisiae sind vorhanden. Mithilfe von Aminosäuresubstitutionen am katalytischen Zentrum (Lys112Ala, Arg114Ala and Arg180Ala) konnte die Bedeutung der für die Katalyse wichtigen Reste der Loops L2 und L4 gezeigt werden.Die Strukturelemente, die wichtig für die Katalyse sind, kommunizieren mit dem Allosteriezentrum, an das der Inhibitor Tyrosin gebunden werden kann. Substitutionen von Aminosäureresten machen deutlich, dass diese Kommunikation einen Signaltransduktionsweg innerhalb des Monomers beinhaltet. Die Inhibitorbindung resultiert in dem Verlust des Kontaktes zwischen den Loops L3 (Leu160) und L2 (Glu111). Durch die Bindung des Inhibitors wird Loop L3 neben den β-Faltblattstrukturen β0*, β6a und β6b zum Inhibitormolekül gezogen, wodurch das katalytische Zentrum destabilisiert wird. Außerdem führt die Bindung des Inhibitors zur Kommunikation zwischen den zwei Monomeren eines Dimers durch den Verlust von intermolekularen Kontakten in Form von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Helix α4 des einen Monomers (Gln185, Arg188, Glu189) und Loop L2 des anderen Monomers (Arg114, Thr115, Lys120). Das verstärkt den destabilisierenden Effekt auf das katalytische Zentrum. Diese dualen inhibitorischen Wege resultieren vermutlich in einer reduzierten Substratbindefähigkeit, wodurch die Aktivität des Enzyms reduziert wird. Native PAGE Experimente deuten daraufhin, dass das Dimer der bevorzugte Oligomerzustand von Aro4p ist.Phenylalanin ist nur bekannt als Rückkopplungsinhibitor der ARO3 kodierten DAHP synthase der Hefe. Wir haben untersucht, ob der Phenylalanin spezifische Ast des aromatischen Aminosäure Biosyntheseweges ebenfalls Subjekt der Phenylalanin-Regulation ist. Hierfür wurde die durch PHA2 kodierte Prephenat-Dehydratase als Strep tag® Fusionsprotein exprimiert und aufgereinigt. Das Enzym zeigte eine Michaelis-Menten-Kinetik mit einem kcat von 16 s-1. Ein einziger Aminosäureaustausch in der NSRP-Region (Asp308Glu) der Domäne, die Ähnlichkeit zur regulatorischen ACT-Domäne hat, resultiert in einem signifikant in der spezifischen Aktivität reduzierten Enzym, welches Feedback-reguliert ist durch Phenylalanin. Diese Daten deuten daraufhin, dass das Pha2-Protein einen regulierten Vorläufer hat, der im Laufe der Evolution seine Regulation verloren hat.Ein Hefestamm mit einer unregulierten und konstitutiv aktiven Chorismat-Mutase Aktivität, der zusätzlich defekt im Transkriptionsnetzwerk der Allgemeinen Kontrolle der Aminosäurebiosynthese ist (ARO7c, gcn4), ist im Wachstum beeinträchtigt, wenn Phenylalanin ins Kultivierungsmedium gegeben worden ist. Dieser sogenannte Phe-Effekt kann unterdrückt werden, wenn der durch TRP2/TRP3 kodierte Anthranilat-Synthase-Komplex zu Beginn des Tryptophan-Wegs überexprimiert wird. Ebenso kann durch die Zugabe von Anthranilat oder Tryptophan das Wachstum wieder hergestellt werden, was daraufhin deutet, dass der Phe-Effekt durch eine Tryptophan-Verhungerung zustande kommt. Die durch das ARO4-Gen kodierte Tyrosin-regulierte DAHP Synthase zu Beginn des Shikimatwegs wird auch, jedoch weniger effektiv, durch eine Rückkopplung mit Phenylalanin inhibiert. Durch die Substitution des ARO4-Gens durch ein Allel, das für ein unreguliertes Enzym (Aro4pT162L) kodiert, wird der Phe-Effekt aufgehoben und der resultierende ARO4T162L, gcn4, ARO7c Stamm ist in der Lage in Anwesenheit von Phenylalanin zu wachsen. Der Phe-Effekt ist also das Resultat einer zusätzlichen Regulation des ARO4-Genproduktes durch Phenylalanin, was zu einem verringerten metabolischem Fluss zu Chorismat führte. Eine konstitutiv aktive Chorismat-Mutase muss unter diesen Umständen mithilfe der generellen Kontrolle entgegengewirkt werden, um dem Phe-Effekt vorzubeugen.