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The tyrosine regulated DAHP synthase and the biosynthetic pathway of aromatic amino acids in Saccharomyces cerevisiae

dc.contributor.advisorBraus, Gerhard Prof. Dr.de
dc.contributor.authorGrzeganek, Andreade
dc.date.accessioned2012-04-16T14:47:15Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:51Zde
dc.date.issued2006-10-30de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-AC2E-0de
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-166
dc.description.abstract3-Deoxy-D-arabino-Heptulosonat 7-Phosphat (DAHP) Synthasen (EC 2.5.1.54) katalysieren die erste Reaktion des Biosyntheseweges. Das aus der Glykolyse kommende Phosphoenolpyruvat (PEP) und das aus dem Pentosephosphatweg stammende Erythrose-4-Phosphat (E4P) werden zu DAHP kondensiert. In der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae liegen zwei DAHP Synthasen vor, die durch die Gene ARO3 und ARO4 kodiert werden und durch die Endprodukte Phenylalanin bzw. Tyrosin inhibiert werden können. Kristallstrukturen von der Phenylalanin regulierten DAHP Synthase aus Escherichia coli und dem Tyrosin inhibierbaren Isoenzym aus S. cerevisiae sind vorhanden. Mithilfe von Aminosäuresubstitutionen am katalytischen Zentrum (Lys112Ala, Arg114Ala and Arg180Ala) konnte die Bedeutung der für die Katalyse wichtigen Reste der Loops L2 und L4 gezeigt werden.Die Strukturelemente, die wichtig für die Katalyse sind, kommunizieren mit dem Allosteriezentrum, an das der Inhibitor Tyrosin gebunden werden kann. Substitutionen von Aminosäureresten machen deutlich, dass diese Kommunikation einen Signaltransduktionsweg innerhalb des Monomers beinhaltet. Die Inhibitorbindung resultiert in dem Verlust des Kontaktes zwischen den Loops L3 (Leu160) und L2 (Glu111). Durch die Bindung des Inhibitors wird Loop L3 neben den β-Faltblattstrukturen β0*, β6a und β6b zum Inhibitormolekül gezogen, wodurch das katalytische Zentrum destabilisiert wird. Außerdem führt die Bindung des Inhibitors zur Kommunikation zwischen den zwei Monomeren eines Dimers durch den Verlust von intermolekularen Kontakten in Form von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Helix α4 des einen Monomers (Gln185, Arg188, Glu189) und Loop L2 des anderen Monomers (Arg114, Thr115, Lys120). Das verstärkt den destabilisierenden Effekt auf das katalytische Zentrum. Diese dualen inhibitorischen Wege resultieren vermutlich in einer reduzierten Substratbindefähigkeit, wodurch die Aktivität des Enzyms reduziert wird. Native PAGE Experimente deuten daraufhin, dass das Dimer der bevorzugte Oligomerzustand von Aro4p ist.Phenylalanin ist nur bekannt als Rückkopplungsinhibitor der ARO3 kodierten DAHP synthase der Hefe. Wir haben untersucht, ob der Phenylalanin spezifische Ast des aromatischen Aminosäure Biosyntheseweges ebenfalls Subjekt der Phenylalanin-Regulation ist. Hierfür wurde die durch PHA2 kodierte Prephenat-Dehydratase als Strep tag® Fusionsprotein exprimiert und aufgereinigt. Das Enzym zeigte eine Michaelis-Menten-Kinetik mit einem kcat von 16 s-1. Ein einziger Aminosäureaustausch in der NSRP-Region (Asp308Glu) der Domäne, die Ähnlichkeit zur regulatorischen ACT-Domäne hat, resultiert in einem signifikant in der spezifischen Aktivität reduzierten Enzym, welches Feedback-reguliert ist durch Phenylalanin. Diese Daten deuten daraufhin, dass das Pha2-Protein einen regulierten Vorläufer hat, der im Laufe der Evolution seine Regulation verloren hat.Ein Hefestamm mit einer unregulierten und konstitutiv aktiven Chorismat-Mutase Aktivität, der zusätzlich defekt im Transkriptionsnetzwerk der Allgemeinen Kontrolle der Aminosäurebiosynthese ist (ARO7c, gcn4), ist im Wachstum beeinträchtigt, wenn Phenylalanin ins Kultivierungsmedium gegeben worden ist. Dieser sogenannte Phe-Effekt kann unterdrückt werden, wenn der durch TRP2/TRP3 kodierte Anthranilat-Synthase-Komplex zu Beginn des Tryptophan-Wegs überexprimiert wird. Ebenso kann durch die Zugabe von Anthranilat oder Tryptophan das Wachstum wieder hergestellt werden, was daraufhin deutet, dass der Phe-Effekt durch eine Tryptophan-Verhungerung zustande kommt. Die durch das ARO4-Gen kodierte Tyrosin-regulierte DAHP Synthase zu Beginn des Shikimatwegs wird auch, jedoch weniger effektiv, durch eine Rückkopplung mit Phenylalanin inhibiert. Durch die Substitution des ARO4-Gens durch ein Allel, das für ein unreguliertes Enzym (Aro4pT162L) kodiert, wird der Phe-Effekt aufgehoben und der resultierende ARO4T162L, gcn4, ARO7c Stamm ist in der Lage in Anwesenheit von Phenylalanin zu wachsen. Der Phe-Effekt ist also das Resultat einer zusätzlichen Regulation des ARO4-Genproduktes durch Phenylalanin, was zu einem verringerten metabolischem Fluss zu Chorismat führte. Eine konstitutiv aktive Chorismat-Mutase muss unter diesen Umständen mithilfe der generellen Kontrolle entgegengewirkt werden, um dem Phe-Effekt vorzubeugen.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.htmlde
dc.titleThe tyrosine regulated DAHP synthase and the biosynthetic pathway of aromatic amino acids in Saccharomyces cerevisiaede
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedDie Tyrosin regulierte DAHP Synthase und der Biosyntheseweg der aromatischen Aminosäuren in Saccharomyces cerevisiaede
dc.contributor.refereeBraus, Gerhard Prof. Dr.de
dc.date.examination2005-11-02de
dc.subject.dnb570 Biowissenschaften, Biologiede
dc.description.abstracteng3-Deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate (DAHP) synthases (EC 2.5.1.54) catalyze the initial reaction of the aromatic amino acid biosynthetic pathway. Phosphoenolpyruvate (PEP) and erythrose-4-phosphate (E4P) are condensed to DAHP. There are two DAHP synthases in baker´s yeast Saccharomyces cerevisiae, encoded by the genes ARO3 and ARO4, that can be feedback-inhibited by phenylalanine and tyrosine, respectively. Crystal structures of the phenylalanine regulated DAHP synthase of Escherichia coli and of the tyrosine inhibitable isoenzyme of S. cerevisiae are available. With the help of amino acid substitutions at the catalytic center (Lys112Ala, Arg114Ala and Arg180Ala), the amino acid residues located in the loops L2 and L4 were shown to be essential for catalysis.The structural elements of the allosteric site where the feedback-inhibitor tyrosine can be bound have to communicate to the catalytic center. Amino acid residue substitutions revealed that this communication includes a signal transduction pathway within the DAHP synthase monomer. Inhibitor binding results in a loss of contact between the loop L3 (Leu160) and loop L2 (Glu111). The inhibitor binding pulls the loop L3 in addition to the β-sheets β0*, β6a and β6b towards the inhibitor molecule, which in turn destabilizes the catalytic site. In addition, inhibitior binding results in a crosstalk between the two monomers of a dimer because helix α4 of one monomer (Gln185, Arg188, Glu189) looses intermolecular contacts in the form of hydrogen bonds to loop L2 of the second monomer (Arg114, Thr115, Lys120). This enhances the destabilizing effect on the catalytic center. The dual inhibitory pathways presumably result in reduced binding of substrates which reduces the activity of the enzyme. Native PAGE experiments suggest that the dimer is the preferred oligomerization state of Aro4p.Phenylalanine is only known to feedback-inhibit the ARO3 encoded DAHP synthase of yeast within the pathway. We analyzed whether the phenylalanine-specific branch in the aromatic amino acid biosynthetic pathway is also subject of phenylalanine regulation. Therefore the PHA2 encoded prephenate dehydratase was expressed as Strep tag® fusion protein and purified. The enzyme displayed an unregulated Michaelis-Menten-kinetic with a kcat = 16 s-1. A single amino acid substitution in the NSRP (Asp308Glu) site of a domain with similarities to the ACT regulatory domain resulted in an enzyme with a significant reduced specific activity which can be feedback-inhibited by phenylalanine. These data suggest that the yeast Pha2 protein might be the derivative of a regulated ancestor which has lost the phenylalanine regulation during the course of evolution.A yeast strain with an unregulated and constitutively active chorismate mutase activity which is also defective in the general control transcriptional network (ARO7c, gcn4) is impaired in growth when phenylalanine is added to the cultivation medium. This so-called phe-effect can be suppressed when the genes TRP2/TRP3 encoding the anthranilate synthase complex at the initial step of the tryptophan specific branch are overexpressed. Similarly, the addition of anthranilate or tryptophan can restore growth suggesting that the phe-effect is the result of tryptophan starvation. The ARO4 gene encoding a tyrosine-inhibitable DAHP synthase at the initial step at the shikimate pathway is also but less effectively feedback-inhibited by phenylalanine. When we substituted the ARO4 gene by an allele which results in an unregulated enzyme (Aro4pT162L) the phe-effect was lost and the resulting ARO4T162L, gcn4, ARO7c strain was able to grow in the presence of phenylalanine. Therefore the phe-effect is the result of an additional regulation of the ARO4 gene product besides tyrosine also by phenylalanine which results in a diminished metabolic flux towards chorismate. A constitutively active chorismate mutase has to be counteracted under these conditions by the general control to prevent the phe-effect.de
dc.contributor.coRefereeIrniger, Stefan PD Dr.de
dc.subject.topicMathematics and Computer Sciencede
dc.subject.gerHefede
dc.subject.geraromatische Aminosäurende
dc.subject.gerDAHP Synthasede
dc.subject.gerPrephenat Dehydratasede
dc.subject.engyeastde
dc.subject.engaromatic amino acidsde
dc.subject.engDAHP synthasede
dc.subject.engprephenate dehydratasede
dc.subject.bk42.3de
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1317-0de
dc.identifier.purlwebdoc-1317de
dc.affiliation.instituteBiologische Fakultät inkl. Psychologiede
dc.subject.gokfullWUE 200: Stoffwechsel und Biochemie der Mikroorganismen {Mikrobiologie}de
dc.identifier.ppn520954777de


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