Studien zu den biochemischen und strukturellen Eigenschaften von Snapin und zu seiner Rolle in der neuronalen Exozytose

Abstract

Snapin wurde ursprünglich von Ilardi et., al 1999 als hirnspezifisches Protein beschrieben, das mit SNAP-25, einem zentralen Protein der neuronalen Exozytse, interagiert. Sowohl biochemische Daten über die Bindung an SNAP-25 und Einfluss von Snapin auf die Interaktion zwischen dem SNARE-Komplex und Synaptotagmin als auch elektrophysiologische Versuche mit Snapinfragmenten ließen für Snapin eine regulatorische Rolle in der neuronalen Exozytose vermuten. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde Snapin biochemisch und in struktureller Hinsicht charakterisiert. Zwei Snapin-Antisera wurden hergestellt, die sowohl rekombinantes wie natives Snapin im gefalteten und denaturierten Zustand erkennen und somit in unterschiedlichen Immunotechniken einsetzbar sind. Mit diesen Antikörpern konnte gezeigt werden, dass Snapin ein ubiquitäres Protein ist, das sowohl im Zytoplasma wie membranassoziiert vorliegt. Die Membranassoziation ist nicht auf eine putative Trasmembrandomäne zurückzuführen, wie Computeranalysen, TritonX-114-Verteilung und nicht zuletzt die Löslichkeit des rekombinanten Proteins in detergenzfreien Lösungen zeigen. Rekombinantes Snapin liegt in Lösung als Dimer vor. Das Protein besitzt einen a-helikalen Gehalt von 64%. Die a-helikalen Bereiche weisen eine Übergangstemperatur von 58°C und können sich komplett nach einer chemischen oder thermischen Denaturierung zurückfalten. Erste Snapinkristalle in Form von hexagonalen Stäbchen mit scharfen Kanten bis 200 µm Länge wurden erhalten. Allerdings ließ sich die Auflösung wahrscheinlich aufgrund einer intrinsischen Unordnung nicht mehr als auf 5,5 Å verbessern. Die kristallographischen Daten lassen eine trigonale oder hexagonale Raumgruppe vermuten. Snapin ist ein evolutiv konserviertes Protein. Die Konservierung unter den Chordatieren beträgt 72% über einen mittleren Bereich von 100 Aminosäuren (bei Gesamtlänge von 136 Aminosäuren). Homologe Proteine wurde auch in Invertebraten (Caenorhabditis elegans und Drosophila melanogaster) und Pflanzen Arabidopsis thaliana) gefunden. Die Funktion dieses Proteins ist noch nicht aufgeklärt. Daten aus dieser Studie zeigen, dass eine direkte spezifische Interaktion zwischen Snapin und SNAP-25 sowie eine Assoziation mit dem SNARE-Komplex weder in vivo noch in vitro nachgewiesen werden konnte. Auch andere Daten wie ubiquitäre Verteilung, fehlende evolutive Konservierung der Aminosäurensequenz, die für die Interaktion mit SNAP-25 und elektrophysiologische Effekte verantwortlich ist, und neu publizierte Interaktionspartner für Snapin, die nicht an der Neurotransmitterfreisetzung beteiligt sind, stellen die Rolle von Snapin in der neuronalen Exozytose in Frage und lassen andere zusätzliche Funktionen für dieses Protein vermuten.