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Untersuchung des transkriptionellen Mechanismus der Igf2- Überexpression in Patched-assoziierten Tumoren

dc.contributor.advisorHahn, Heidi Prof. Dr.de
dc.contributor.authorBauer, Reginede
dc.date.accessioned2012-04-16T14:47:19Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:51Zde
dc.date.issued2006-12-06de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-AC37-9de
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-175
dc.description.abstractZum besseren Verständnis der Entstehung und der Progression von Rhabdomyosarkomen (RMS) in heterozygoten Ptch-Mutanten wurden in der vorliegenden Arbeit die transkriptionellen Mechanismen der paternalen Überexpression des Wachstumsfaktors Igf2 untersucht.Die detaillierte Analyse der Promotoraktivität des Igf2-Gens in RMS zeigte, dass die aberrante Überexpression von drei Transkripten (T1, T2 und T3) auf die Aktivierung von drei Promotoren (P1, P2 und P3) zurückzuführen ist. In die Überexpression können sowohl aktivierende Transkriptionsfaktoren als auch epigenetische Mechanismen (DNA-Methylierung und Azetylierung) involviert sein. Beide Mechanismen wurden in der vorliegenden Arbeit untersucht.Igf2 ist ein Zielgen des im RMS abnormal aktivierten Shh/ Gli-Signalweges. Durch bioinformatische Recherchen wurden erstmalig fünf Gli-Konsensussequenzen im Igf2-Lokus nachgewiesen. Mittels quantitativer real-time QRT-PCR, Luziferase- und β-Galaktosidase-Assay wurde deren Funktionalität untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die endogene Igf2-Expression durch Gli-Transkriptionsfaktoren stimulierbar ist.Mit Hilfe von methylierungssensitiver Southern-Blot-Technik konnten zwischen Normalgewebe und RMS Methylierungsveränderungen in den differentiell methylierten Regionen (DMRs) des Igf2-Lokus identifiziert werden. Aberrante Methylierungen wurden mittels einer Bisulfit-Sequenzierung näher charakterisiert und auf ihre Signifikanz hin untersucht. So wurden im Tumor in einem Bereich der DMR1 eine Hypomethylierung und in der DMR2 eine Hypermethylierung nachgewiesen. Die Methylierungsveränderungen betreffen hierbei Bereiche, von denen bisher nicht bekannt war, dass sie in die Regulation der Igf2-Gen Expression involviert sind.Owohl die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit auf eine Beteiligung der Gli-Transkriptionsfaktoren und der DNA-Methylierung an der Igf2-Überexpression in RMS hinweisen, konnte ein direkter Zusammenhang zwischen modifizierter DNA und der damit verbundenen Veränderung der Chromatinstruktur sowie der transkriptionellen Regulierung des Igf2-Gens durch die Gli-Transkriptionsfaktoren nicht erbracht werden. Deshalb wird es Ziel weiterer und an diese Arbeit anküpfender Studien sein, einen solchen Zusammenhang herzustellen. So kann, z. B., über CHIP- oder EMSA-Assays eine direkte Interaktion der Gli-Transkriptionsfaktoren mit der DNA des Igf2 nachgewiesen werden. Ein Experiment, welches den Nachweis erbringen würde, dass die DNA-Hypermethylierung der DMR2 die Aktivität der Gli-Transkriptionsfaktoren beeinflusst und an einer Überexpression des Igf2-Gens in vivo beteiligt ist, bestünde beispielsweise in der Herstellung eines Reporterkonstruktes, welches in frame in den offenen Leserahmen des Luziferasegenes gebracht wird. Nach einer in vitro-Methylierung des Konstruktes und Kotransfektion mit Gli-Expressionsvektoren könnte nicht nur eine Aussage über den Einfluss der Methylierung der DMRs auf die Igf2-Expression, sondern auch über eine mögliche Interaktion der DMR-DNA mit Gli-Transkriptionsfaktoren getroffen werden.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isogerde
dc.rights.urihttp://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.htmlde
dc.titleUntersuchung des transkriptionellen Mechanismus der Igf2- Überexpression in Patched-assoziierten Tumorende
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedInvestigation of the transcriptional mechanism of the Igf2-overexpression in Patched-associated tumoursde
dc.contributor.refereeEngel, Wolfgang Prof. Dr.de
dc.date.examination2006-05-02de
dc.subject.dnb570 Biowissenschaften, Biologiede
dc.description.abstractengFor a better understanding of the formation and progression of Rhabdomyosarcoma (RMS) in heterocygous Ptch mutants, the present study was devoted to the transcriptional mechanisms of the paternal overexpression of the growth factor Igf2 in RMS.A detailed analysis of the Igf2 promoter activity revealed that three transcripts (T1, T2, T3) are overexpressed and therefore three promoters (P1, P2, P3) are aberrantly activated in RMS. The activation of transcription factors as well as epigenetic mechanisms (DNA methylation and acetylation) may be responsible for this effect. Both mechanisms were examined in the present study.Igf2 is a target gene of the Shh/ Gli signalling pathway which is aberrantly activated in RMS. By means of bioinformatical analyses, five consensus Gli binding sites were found in the Igf2 locus and described here for the first time. Using quantitative real-time QRT-PCR, luciferase- and β-galactosidase assays, the functionality of these binding sites was studied. It could be shown, that the endogenous Igf2 expression can be stimulated by the Gli transcription factors.By means of the methylation sensitive southern blot technique, differences in the methylation of the differentially methylated regions (DMRs) of the Igf2 locus could be detected between normal tissue and RMS. Using bisulfite sequencing, this aberrant methylation was further characterised and examined for significance. Thus, in the DNA of the tumour significant hypomethylation was found in DMR1 and hypermethylation in DMR2. These changes in the regular methylation were found in regions that up to date have not been implicated with the regulation of the Igf2 expression.Although the results of this study suggest the involvement of Gli transcription factors and DNA methylation in the overexpression of Igf2 in RMS, a direct link between DNA modifications on one side and changes in the chromatin structure as well as a Gli mediated overexpression of Igf2 on the other side remains to be provided.It may therefore be the aim of subsequent studies to provide such a link. Subjects of such studies may be CHIP and EMSA assays that could proof a direct interaction between Gli transcription factors and the Gli binding sites in the Igf2 locus. Another experiment that could provide evidence for the DNA hypermethylation of DMR2 influencing the activity of Gli transcription factors would be the generation of a reporter construct which is in frame with the luciferase gene. After in vitro methylation of this construct and co-transfection with Gli expression vectors a statement could be made about the influence of the methylation of the DMRs on reporter activity.de
dc.contributor.coRefereeHoyer-Fender, Sigrid PD Dr.de
dc.subject.topicMathematics and Computer Sciencede
dc.subject.gerIgf2-Überexpression in Rhabdomyosarcom (RMS)de
dc.subject.gerPatched-Mutationde
dc.subject.germethylierungssensitive Southern-Blot Technikde
dc.subject.gerDNA-Methylierungsveränderungen des Igf2-Lokusde
dc.subject.gerBisulfitsequenzierungde
dc.subject.gerGli-Transkriptionsfaktorende
dc.subject.engIgf2 overexpression in rhabdomyosarcoma (RMS)de
dc.subject.engmutations in patchedde
dc.subject.engmethylation sensitive southern blot techniquede
dc.subject.engalterations of methylation in Igf2de
dc.subject.engbisulfite sequencingde
dc.subject.engGli transcription factorsde
dc.subject.bk42.13 Molekularbiologiede
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-1353-9de
dc.identifier.purlwebdoc-1353de
dc.affiliation.instituteBiologische Fakultät inkl. Psychologiede
dc.subject.gokfullWF 000 Molekularbiologiede
dc.subject.gokfullGentechnologiede
dc.subject.gokfullMED 301 Humangenetikde
dc.subject.gokfullMED 424 Onkologiede
dc.identifier.ppn579210219de


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