Regulation der Neurogenese durch bHLH-O-Proteine in Xenopus laevis
Regulation of Neurogenesis by bHLH-O-Proteins in Xenopus laevis
by Marion Sölter
Date of Examination:2006-01-18
Date of issue:2006-12-11
Advisor:Prof. Dr. Tomas Pieler
Referee:Prof. Dr. Tomas Pieler
Referee:Prof. Dr. Ernst A. Wimmer
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Size:11.6Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Transcriptional activators and repressors of the bHLH protein family are involved in multiple developmental processes, including the formation of the nervous system in vertebrates and invertebrates. bHLH-O proteins play a particularly important role in the determination of neural cell fates and the regulation of neurogenesis. The Drosophila Hairy and E(spl)-related bHLH repressors can inhibit neural and neuronal differentiation through the repression of proneural bHLH protein activity. To gain further insight into the regulative mechanisms and the function of numerous bHLH-O proteins during neurogenesis, new members of the bHLH-O protein family in Xenopus were identified in silico and several of these proteins were further characterized.In this work, XHes2, a novel Hairy and E(spl)-related bHLH protein was identified that is closely related to the mammalian Hes2. The expression of XHes2 in the developing sensory organs and central nervous system implicates this gene as a potential regulator of neurogenesis. Studies analyzing the regulation of XHes2 in embryos revealed that XHes2 cannot be induced within the neural plate by the proneural bHLH protein X-Ngnr-1 or by the activation of the Notch signalling pathway. XHes2 expression in neural plate stages is restricted to the otic placode and some few cells within the neural plate. Taken together, these results indicate that XHes2, in contrast to Hes5 related genes such as ESR1 und ESR7, is not involved in the Notch-dependent lateral inhibition during primary neurogenesis. In misexpression studies using hormone inducible XHes2 variants in Xenopus embryos and animal caps, XHes2 inhibits neurogenesis similar to other bHLH-O proteins. This was obtained not only by the negative transcriptional regulation of X-Ngnr-1 und NeuroD, but also by the inhibition of NeuroD activity. The ectopic expression of NeuroD in late neurula stages upon injection of a XHes2 antisense morpholino oligonucleotide supports the hypothesis that XHes2 in developing sensory organs and forming CNS inhibits neuronal differentiation and thereby influences cell fate.While most of the mammalian bHLH-O proteins have only a single homologous protein in Xenopus, eight different mouse Hes5 related proteins could be identified in Xenopus. Out of these, the highly related proteins ESR8, ESR9 und ESR10 were analysed in more detail. During embryonic development, the expression domains of these Notch inducible genes are very similar. All three genes are expressed in the proneural domains, in the developing somites and in the pancreas. The expression pattern in neural plate stages implicates a regulatory function of these proteins during primary neurogenesis, probably by Notch dependent lateral inhibition. The misexpression of hormone inducible variants of ESR8, ESR9 and ESR10 in embryos from the midgastrula stage onwards support this hypothesis as the transcription of X-Ngnr-1 und N-tubulin is negatively regulated by inducible wildtype proteins and positively regulated by corresponding DNA binding mutants. Furthermore, ESR8 inhibits not only the transcription of X-Ngnr-1, but also the activity of X-Ngnr-1. Alternatively, the reduction of primary neurons upon injection of ESR8/ESR9/ESR10 specific antisense morpholino oligonucleotides in embryos suggests another function of these proteins, which takes place before lateral inhibition and demonstrates their necessity for the correct temporal and stereotypical differentiation of primary neurons.
Keywords: <i>Xenopus</i>; Neurogenesis; bHLH; Hes; Hairy; Enhancer of split
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bHLH-Aktivatoren und bHLH-Repressoren sind an zahlreichen Entwicklungsprozessen, einschließlich der Ausbildung des Nervensystems, in Vertebraten und Invertebraten beteiligt. Bei der Bestimmung neuraler Zellschicksale und der Regulation der Neurogenese spielen insbesondere bHLH-O-Proteine eine wesentliche Rolle. Diese mit Drosophila Hairy und E(spl)-verwandten bHLH-Repressoren können die neurale und neuronale Differenzierung durch eine Hemmung proneuraler bHLH-Proteinaktivität verhindern. Um die Regulationsmechanismen während der Neurogenese und die Funktion der zahlreichen bHLH-O-Proteine besser zu verstehen, wurden in Xenopus neue Mitglieder der bHLH-O-Proteinfamilien in silico identifiziert und einige dieser Proteine näher charakterisiert.In dieser Arbeit konnte ein in Xenopus bisher noch nicht beschriebenes Hairy und E(spl) verwandtes Protein identifiziert werden, das eng mit Hes2 aus Säugern verwandt ist. Die Expression von XHes2 in sich entwickelnden Sinnesorganen und im entstehenden zentralen Nervensystems macht dieses Gen zu einem interessanten Kandidaten für einen Regulator der Neurogenese. Untersuchungen zur Regulation von XHes2 in Embryonen ergaben, dass XHes2 innerhalb der Neuralplatte weder durch das proneurale bHLH-Protein X-Ngnr-1 noch durch die Aktivierung des Notch-Signalwegs induziert werden kann. Diese Ergebnisse und die XHes2-Expression in Neuralplattenstadien, die sich auf die Ohrplakode und einige wenige Zellen innerhalb der Neuralplatte beschränkt, zeigen dass XHes2 im Gegensatz zu Hes5-ähnlichen Genen, wie ESR1 und ESR7, keine Rolle bei der Notch-abhängigen lateralen Hemmung während der primären Neurogenese spielt. In Überexpressionsstudien mit verschiedenen, z.T. Hormon-induzierbaren XHes2-Varianten in Embryonen und animalen Kappen konnte nachgewiesen werden, dass XHes2, wie viele andere bHLH-O-Proteine, die Neurogenese hemmt, zum einen durch die negative Regulation der Transkription von X-Ngnr-1 und NeuroD und zum anderen durch Hemmung der NeuroD-Aktivität. Die ektopische NeuroD-Expression in späten Neurulastadien infolge der Injektion eines XHes2-antisense Morpholinooligonukleotids unterstützt die Hypothese, dass XHes2 in sich entwickelnden Sinnesorganen und im entstehenden ZNS die neuronale Differenzierung verhindert und dadurch Einfluß auf das weitere Zellschicksal nimmt. Während die meisten Säuger-bHLH-O-Proteine in Xenopus nur ein ähnliches Protein besitzen, konnten in Xenopus acht verschiedene Maus-Hes5-ähnliche Proteine identifiziert werden. Von diesen wurden die untereinander eng verwandten Proteine ESR8, ESR9 und ESR10 näher untersucht. Während der Embryonalentwicklung unterscheiden sich die Expressionsdomänen der durch Notch-induzierbaren Gene nicht. Alle drei Gene werden in proneuronalen Domänen, in entstehenden Somiten und im Pankreas exprimiert. Das Expressionsmuster in Neuralplattenstadien impliziert eine regulatorische Funktion dieser Proteine während der primären Neurogenese, vermutlich bei der Notch-abhängigen lateralen Hemmung. Die Überexpression hormon-induzierbarer ESR8-, ESR9- und ESR10-Varianten in Embryonen ab dem Midgastrulastadium bestätigt diese Vermutung, da die Transkription von X-Ngnr-1 und N-tubulin durch induzierte Wildtypproteine negativ und durch DNA-Bindungsmutanten positiv reguliert wird. Zudem hemmt ESR8 nicht nur die X-Ngnr-1-Transkription, sondern auch die X-Ngnr-1-Aktivität. Die Reduktion bzw. das Fehlen primärer Neuronen infolge der Injektion von ESR8 bzw. ESR9/ESR10-spezifischen antisense Morpholinooligonukleotide in Embryonen deutet andererseits auf eine weitere, vor der lateralen Hemmung stattfindenden Funktion dieser Proteine hin und zeigt deren Notwendigkeit für eine zeitlich und räumlich korrekte neuronale Differenzierung.
Schlagwörter: <i>Xenopus</i>; Neurogenese; bHLH; Hes; Hairy; Enhancer of split