Regulation der Neurogenese durch bHLH-O-Proteine in Xenopus laevis

Abstract

bHLH-Aktivatoren und bHLH-Repressoren sind an zahlreichen Entwicklungsprozessen, einschließlich der Ausbildung des Nervensystems, in Vertebraten und Invertebraten beteiligt. Bei der Bestimmung neuraler Zellschicksale und der Regulation der Neurogenese spielen insbesondere bHLH-O-Proteine eine wesentliche Rolle. Diese mit Drosophila Hairy und E(spl)-verwandten bHLH-Repressoren können die neurale und neuronale Differenzierung durch eine Hemmung proneuraler bHLH-Proteinaktivität verhindern. Um die Regulationsmechanismen während der Neurogenese und die Funktion der zahlreichen bHLH-O-Proteine besser zu verstehen, wurden in Xenopus neue Mitglieder der bHLH-O-Proteinfamilien in silico identifiziert und einige dieser Proteine näher charakterisiert.In dieser Arbeit konnte ein in Xenopus bisher noch nicht beschriebenes Hairy und E(spl) verwandtes Protein identifiziert werden, das eng mit Hes2 aus Säugern verwandt ist. Die Expression von XHes2 in sich entwickelnden Sinnesorganen und im entstehenden zentralen Nervensystems macht dieses Gen zu einem interessanten Kandidaten für einen Regulator der Neurogenese. Untersuchungen zur Regulation von XHes2 in Embryonen ergaben, dass XHes2 innerhalb der Neuralplatte weder durch das proneurale bHLH-Protein X-Ngnr-1 noch durch die Aktivierung des Notch-Signalwegs induziert werden kann. Diese Ergebnisse und die XHes2-Expression in Neuralplattenstadien, die sich auf die Ohrplakode und einige wenige Zellen innerhalb der Neuralplatte beschränkt, zeigen dass XHes2 im Gegensatz zu Hes5-ähnlichen Genen, wie ESR1 und ESR7, keine Rolle bei der Notch-abhängigen lateralen Hemmung während der primären Neurogenese spielt. In Überexpressionsstudien mit verschiedenen, z.T. Hormon-induzierbaren XHes2-Varianten in Embryonen und animalen Kappen konnte nachgewiesen werden, dass XHes2, wie viele andere bHLH-O-Proteine, die Neurogenese hemmt, zum einen durch die negative Regulation der Transkription von X-Ngnr-1 und NeuroD und zum anderen durch Hemmung der NeuroD-Aktivität. Die ektopische NeuroD-Expression in späten Neurulastadien infolge der Injektion eines XHes2-antisense Morpholinooligonukleotids unterstützt die Hypothese, dass XHes2 in sich entwickelnden Sinnesorganen und im entstehenden ZNS die neuronale Differenzierung verhindert und dadurch Einfluß auf das weitere Zellschicksal nimmt. Während die meisten Säuger-bHLH-O-Proteine in Xenopus nur ein ähnliches Protein besitzen, konnten in Xenopus acht verschiedene Maus-Hes5-ähnliche Proteine identifiziert werden. Von diesen wurden die untereinander eng verwandten Proteine ESR8, ESR9 und ESR10 näher untersucht. Während der Embryonalentwicklung unterscheiden sich die Expressionsdomänen der durch Notch-induzierbaren Gene nicht. Alle drei Gene werden in proneuronalen Domänen, in entstehenden Somiten und im Pankreas exprimiert. Das Expressionsmuster in Neuralplattenstadien impliziert eine regulatorische Funktion dieser Proteine während der primären Neurogenese, vermutlich bei der Notch-abhängigen lateralen Hemmung. Die Überexpression hormon-induzierbarer ESR8-, ESR9- und ESR10-Varianten in Embryonen ab dem Midgastrulastadium bestätigt diese Vermutung, da die Transkription von X-Ngnr-1 und N-tubulin durch induzierte Wildtypproteine negativ und durch DNA-Bindungsmutanten positiv reguliert wird. Zudem hemmt ESR8 nicht nur die X-Ngnr-1-Transkription, sondern auch die X-Ngnr-1-Aktivität. Die Reduktion bzw. das Fehlen primärer Neuronen infolge der Injektion von ESR8 bzw. ESR9/ESR10-spezifischen antisense Morpholinooligonukleotide in Embryonen deutet andererseits auf eine weitere, vor der lateralen Hemmung stattfindenden Funktion dieser Proteine hin und zeigt deren Notwendigkeit für eine zeitlich und räumlich korrekte neuronale Differenzierung.