Funktionelle Analyse des murinen Sall4-Gens
Functional analysis of murine Sall4
by Lina Malinouskaya
Date of Examination:2006-01-18
Date of issue:2007-01-02
Advisor:Prof. Dr. Jürgen Kohlhase
Referee:Prof. Dr. Wolfgang Engel
Referee:PD Dr. Sigrid Hoyer-Fender
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-185
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Description:Dissertation
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Abstract
English
Mutations in human SALL4 gene cause Okihiro syndrome, an autosomal dominant disorder characterised by radial ray abnormalities and Duane anomaly and some other anal, renal, cardiac, ear, foot malformations and hearing loss. All of the mutations in SALL4 lead to preterminal stop codons and are thought to cause the phenotype via haploinsufficiency. In the present study the function of murine homologue of SALL4 gene was investigated by means of gene trap mouse line.Sall4 expressed in the blastocyst stage embryos in the inner cell mass and in the trophectoderm cells. In E7.5 embryos Sall4 expression was found in the cardiac crescent, the region of future myocardial plate. Sall4 expression was also notable in the migrating neural crest cells which are involved in generation of outflow tract of the heart. New splice variant Sall4 minor which utilises alternative exon 1a instead of exon 1 was characterised. Quantitative RT-PCR showed that the Sall4 major transcript was largely disrupted by the gene trap vector integration between exon 1 and exon 1a. The expression level of Sall4 minor transcript was reduced by 30% in heterozygotes and by 50% in homozygous embryos. No apparent phenotype was observed in the heterozygous mutants. Sall4 homozygous embryos were developmentally delayed and die around E7.5 because of heart failure, foregut deformation and open neural tube. Strong reduction of the expression level of Tbx1 and Tbx5 was observed in homozygous embryos; in contrast, the expression of these genes was almost unaffected in Sall4 heterozygous embryos. This result indicates that expression of T-box genes which are involved in early cardiogenesis might be regulated by Sall4 and gene dosage is important for this regulation. Therefore, Sall4 could be an important transcriptional regulator which plays an essential role during cardiogenesis. Transfection experiments with myc-tagged Sall1 truncated construct revealed a clear displacement of Sall4 protein from the nucleus and cytoplasmic co-localisation with truncated Sall1 protein. Another evidence of Sall4-Sall1 interaction was provided by breeding experiments of heterozygous mice from Sall4 gene trap line and Sall1 knockout mouse line. The severe reduction of double heterozygous Sall1/Sall4 mice indicates the synergistic functional role and interaction between Sall1 and Sall4 gene on the genetic level.
Keywords: Okihiro syndrome; Sall4; gene trap; heart development; neural crest; Sall1
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Mutationen im humanen SALL4 Gen verursachen das Okihiro Syndrom, eine autosomal-dominante vererbte Erkrankung, die durch eine Kombination von Duane-Anomalie und Fehlbildungen des Radius charakterisiert ist. Daneben sind auch Herzfehler, Hörstörungen und anale Fehlbildungen beschrieben worden. Alle bisher bekannten Mutationen des SALL4-Gens resultieren in präterminalen Stop-Kodons und scheinen den Phänotyp durch Haploinsuffizienz zu verursachen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion des SALL4 Gens der Maus anhand einer "gene trap"-Mauslinie untersucht. Dabei wurde festgestellt, daß Sall4 im Blastocysten-Stadium in der inneren Zellmasse und in Trophektodermzellen exprimiert wird. In E7.5 embryos konnte Sall4 Expression in der Mesenchymplatte nachgewiesen werden, der Region, in der das Herz (kardiogene Platte) angelegt wird. Ferner wird Sall4 in den wandernden Neuralleistenzellen exprimiert, die in die Bildung des Ausflusstrakts des Herzens involviert sind. Außerdem wurde eine neue Spleiss-Variante, Sall4 minor, charakterisiert, die ein alternatives Exon 1a anstelle von Exon 1 verwendet. Die Integration des "gene trap"-Vektors erfolgte zwischen Exon1 und Exon 1a. Mit Hilfe von quantitativer RT-PCR konnte gezeigt werden, daß das Sall4 major Transkript durch diese Integration unterbrochen wird. Das Expressionslevel des Sall4 minor Transkripts ist in heterozygoten Embryos um 30% und in homozygoten Embryos um 50% reduziert. In den heterozygoten Mutanten konnte kein offensichtlicher Phänotyp beobachtet werden. Sall4 homozygote Embryos sind in ihrer Entwicklung verlangsamt und sterben etwa in Stadium E7.5 an Fehlbildungen des Herzens, des Darms sowie einem offenen Neuralrohr. Sie zeigen eine starke Abnahme im Expressionlevel von Tbx1 and Tbx5, dagegen ist die Expression dieser Gene in Sall4 heterozygoten Embryos kaum beeinträchtigt. Dies weist daraufhin, dass die Expression von T-box Genen, die an der frühen Kardiogenese beteiligt sind, möglicherweise durch Sall4 reguliert wird und dass die Anzahl der Genkopien wichtig ist für diese Steuerung. Sall4 könnte demnach einen Transkriptionsregulator mit einer essentiellen Rolle in der Kardiogenese darstellen. Transfektionsexperimente mit einem myc-markiertem verkürzten Sall1-Konstrukt ergaben, dass das Sall4 Protein nicht im Nukleus, sondern mit dem verkürzten Sall1 protein im Cytoplasma co-lokalisiert ist. Ein weiterer Hinweis auf eine Sall4-Sall1 Interaction wurde durch Kreuzung von heterozygoten Tieren der Sall4 "gene trap"-Linie und der Sall1 knockout-Mauslinie erhalten. Die äußerst geringe Anzahl an doppelt heterozygoten Sall1/Sall4 Mäusen deutet auf eine synergistische Rolle sowie eine Interaktion von Sall1 and Sall4 auf genetischer Ebene hin.
Schlagwörter: Okihiro-Syndrom; Sall4; gene trap; Herzentwicklung; Neuralleiste; Sall1