Funktionelle Analyse des murinen Sall4-Gens

Abstract

Mutationen im humanen SALL4 Gen verursachen das Okihiro Syndrom, eine autosomal-dominante vererbte Erkrankung, die durch eine Kombination von Duane-Anomalie und Fehlbildungen des Radius charakterisiert ist. Daneben sind auch Herzfehler, Hörstörungen und anale Fehlbildungen beschrieben worden. Alle bisher bekannten Mutationen des SALL4-Gens resultieren in präterminalen Stop-Kodons und scheinen den Phänotyp durch Haploinsuffizienz zu verursachen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion des SALL4 Gens der Maus anhand einer "gene trap"-Mauslinie untersucht. Dabei wurde festgestellt, daß Sall4 im Blastocysten-Stadium in der inneren Zellmasse und in Trophektodermzellen exprimiert wird. In E7.5 embryos konnte Sall4 Expression in der Mesenchymplatte nachgewiesen werden, der Region, in der das Herz (kardiogene Platte) angelegt wird. Ferner wird Sall4 in den wandernden Neuralleistenzellen exprimiert, die in die Bildung des Ausflusstrakts des Herzens involviert sind. Außerdem wurde eine neue Spleiss-Variante, Sall4 minor, charakterisiert, die ein alternatives Exon 1a anstelle von Exon 1 verwendet. Die Integration des "gene trap"-Vektors erfolgte zwischen Exon1 und Exon 1a. Mit Hilfe von quantitativer RT-PCR konnte gezeigt werden, daß das Sall4 major Transkript durch diese Integration unterbrochen wird. Das Expressionslevel des Sall4 minor Transkripts ist in heterozygoten Embryos um 30% und in homozygoten Embryos um 50% reduziert. In den heterozygoten Mutanten konnte kein offensichtlicher Phänotyp beobachtet werden. Sall4 homozygote Embryos sind in ihrer Entwicklung verlangsamt und sterben etwa in Stadium E7.5 an Fehlbildungen des Herzens, des Darms sowie einem offenen Neuralrohr. Sie zeigen eine starke Abnahme im Expressionlevel von Tbx1 and Tbx5, dagegen ist die Expression dieser Gene in Sall4 heterozygoten Embryos kaum beeinträchtigt. Dies weist daraufhin, dass die Expression von T-box Genen, die an der frühen Kardiogenese beteiligt sind, möglicherweise durch Sall4 reguliert wird und dass die Anzahl der Genkopien wichtig ist für diese Steuerung. Sall4 könnte demnach einen Transkriptionsregulator mit einer essentiellen Rolle in der Kardiogenese darstellen. Transfektionsexperimente mit einem myc-markiertem verkürzten Sall1-Konstrukt ergaben, dass das Sall4 Protein nicht im Nukleus, sondern mit dem verkürzten Sall1 protein im Cytoplasma co-lokalisiert ist. Ein weiterer Hinweis auf eine Sall4-Sall1 Interaction wurde durch Kreuzung von heterozygoten Tieren der Sall4 "gene trap"-Linie und der Sall1 knockout-Mauslinie erhalten. Die äußerst geringe Anzahl an doppelt heterozygoten Sall1/Sall4 Mäusen deutet auf eine synergistische Rolle sowie eine Interaktion von Sall1 and Sall4 auf genetischer Ebene hin.