Struktur-Funtionsbeziehung in den spleißosomalen Proteinen des U4/U6•U5 tri-snRNP

Abstract

Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist der spleißosomale U5-Partikel. Beschrieben werden Untersuchungen funktionaler Beziehungen, die biochemisch mittels limitierter Proteolysen und spektrometrischer Messungen durchgeführt wurden, da die direkte Strukturanalyse des Spleißosoms aufgrund seiner hohen Dynamik und Heterogenität noch nicht möglich ist. Die Definition eines kleinsten interagierenden Bereichs bildet die Grundlage für die zukünftige Röntgenstrukturanalyse des Partikels. Der erste Schritt zu dieser Definition sind die Herstellung der beteiligten Proteinkomponenten des Partikels in kristallisierbaren Mengen und ihre Charakterisierung. Dies wurde in dieser Arbeit durchgeführt.Verschiedene Wege der Proteinproduktion wurden erprobt; folgendes sind die Resultate: Erstens ist die bakterielle Expression der humanen U5-spezifischen Proteine aufgrund der fehlenden Chaperone, Membranen und modifizierenden Enzyme keine erfolgversprechende Methode. Zweitens produziert Hefe keine für Kristallisationsexperimente hinreichenden Mengen spleißosomalen Proteins. Drittens aber ist es im Rahmen dieser Arbeit erstmalig gelungen, heterotetrameren Subkomplex aus HeLa-Kernextrakten in Mengen herzustellen, die für Kristallisationsversuche ausreichend sind. Die Daten, die aus den limitierten Proteolysen gewonnen wurden, konnten genutzt werden, um einen interagierenden Kernpartikel zu definieren, welcher in zukünftigen Experimenten zur Kristallisation gebracht werden kann. Diese Daten und das etablierte Insektenzellsystem machen nun Experimente möglich, die bislang nicht durchführbar waren, wie beispielsweise die heterologe Expression der U5-spezifischen Proteine in Zelllinien höherer Eukaryonten und die Rekonstitution des interagierenden Kernbereichs, bzw. des U5-Partikels. Weiterhin ist neben der biochemischen Charakterisierung die strukturbiologische Analyse näher gerückt.