Functional analysis of the GlnK1 protein of Methanosarcina mazei strain Gö1: Aspects of nitrogen regulation

Ehlers, Claudia

dc.contributor.advisor	Schmitz-Sreit, Ruth Prof. Dr.	de
dc.contributor.author	Ehlers, Claudia	de
dc.date.accessioned	2012-04-16T14:47:32Z	de
dc.date.available	2013-01-30T23:50:47Z	de
dc.date.issued	2005-09-26	de
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-AC4D-A	de
dc.identifier.uri	http://dx.doi.org/10.53846/goediss-197
dc.description.abstract	PII-Proteine, zu denen GlnB und GlnK zählen, sind ubiquitär verbreitete kleine Regulatorproteine, die den internen Stickstoffzustand der Zelle sensieren und weiterleiten und hierdurch maßgeblich an der Regulation des Stickstoffmetabolismus beteiligt sind.Ziel dieser Arbeit war es, das GlnK1-Protein aus dem methanogenen Archeaon Methanosarcina mazei Stamm Gö1 umfassend zu charakterisieren und seine potentielle Rolle in der Regulation des Stickstoffmetabolismus aufzuklären. Das M. mazei GlnK1-Protein weist den typischen Tyrosin51-Rest auf, der in Bakterien stickstoffabhängig posttranslationell modifiziert wird. Sowohl in vitro als auch in vivo Experimente haben jedoch gezeigt, dass GlnK1 in M. mazei nicht stickstoffabhängig modifiziert wird. Weitere strukturelle Unterschiede zu bakteriellen PII-Proteinen haben Experimente zur Bildung von Heterotrimeren aufgezeigt. Trotz dieser deutlichen Unterschiede haben Komplementationsversuche ergeben, dass das archaeelle GlnK-Protein in der Lage ist, E. coli GlnK funktionell zu komplementieren. Dieses läßt darauf schließen, dass das GlnK1-Protein in M. mazei auch in der Regulation des Stickstoffmetabolismus involviert ist. Um dieses zu bestätigen, wurde eine chromosomale M. mazei glnK1-Mutante generiert. Hierfür war es erforderlich, zunächst ein funktionelles System zur Transformation von M. mazei Gö1 zu entwickeln. Es gelang, (i) durch Selektion einer potentiellen spontanen Zellwandmutante von M. mazei, die eine stark verbesserte Plattierungseffizienz aufwies, sowie (ii) durch mehrere Modifizierungen des von W. Metcalf (Urbana) entwickelten Liposomen-vermittelten Transformationsprotokolls für Methanosarcina-Stämme M. mazei Gö1 genetisch zugänglich zu machen. Wachstumsanalysen des konstruierten M. mazei glnK1-Mutantenstamms zeigten einen partiell reduzierten Wachstumsphänotyp unter stickstofflimitierenden Bedingungen. Quantitative Reverse Transkriptions-PCR Analysen ausgewählter Gene ergaben allerdings, dass das GlnK1 keinen Einfluss auf die Transkription stickstoffregulierter Gene ausübt.Sowohl biochemische Experimente mit gereinigtem Enzym als auch in vivo Versuche zeigten jedoch, dass das GlnK1-Protein mit der Glutamin-Synthetase (GlnA) interagiert und hierdurch deren Enzymaktivität inhibiert. Ein aktivierender Effekt auf die GlnA Enzymaktivität wurde hingegen bei Anwesenheit von 2-Oxoglutarat beobachtet, welches den internen Stickstoffstatus wiederspiegelt. Aus der Gesamtheit der Ergebnisse läßt sich folgendes hypothetisches Regulationsmodel ableiten: Unter Stickstofflimitierung wird 2-Oxoglutarat akkumuliert, welches die Glutamine-Synthetase Aktivität stark stimuliert; bei einem Übergang zu Stickstoffüberschuss wird die Glutamine-Synthetase sowohl durch einen reduzierten 2-Oxoglutarat-Spiegel als auch durch direkte Protein-Interaktion mit GlnK1 inaktiviert. Letzteres dient der Feinregulation und ermöglicht schnell auf eine veränderte Stickstoffversorgung reagieren zu können.	de
dc.format.mimetype	application/pdf	de
dc.language.iso	eng	de
dc.rights.uri	http://webdoc.sub.gwdg.de/diss/copyr_diss.html	de
dc.title	Functional analysis of the GlnK1 protein of Methanosarcina mazei strain Gö1: Aspects of nitrogen regulation	de
dc.type	doctoralThesis	de
dc.title.translated	Funktionelle Analyse des GlnK1 Proteins aus Methanosarcina mazei Stamm Gö1: Aspekte der Stickstoffregulation	de
dc.contributor.referee	Gottschalk, Gerhard Prof. Dr.	de
dc.date.examination	2004-11-02	de
dc.subject.dnb	570 Biowissenschaften, Biologie	de
dc.description.abstracteng	PII-proteins like GlnB and GlnK are ubiquitous distributed small regulator proteins that play a key role in regulation of nitrogen metabolism by sensing and signalling the intracellular nitrogen status of the cell. The intention of this thesis was to get an insight into the regulation of nitrogen metabolism of M. mazei strain Gö1 by focussing on the contribution of the PII-like protein GlnK1. One major goal was the characterization of the GlnK1 protein concerning transcriptional regulation, synthesis and modification. The second goal was to identify potential interaction partners of GlnK1 and to determine its potential regulatory function.The GlnK1 protein of M. mazei contains the conserved tyrosine residue (Tyr 51) which in bacteria is post-translationally modified dependent on the nitrogen availability. However, both in vitro and in vivo experiments showed that GlnK1 of M. mazei is not modified dependent on nitrogen supplementation. Further structural differences to bacterial PII-like proteins were demonstrated by heterotrimer formation experiments. Despite these distinct differences M. mazei GlnK1 was able to complement growth of an E. coli glnK mutant indicating that the archaeal GlnK protein is involved in regulation of nitrogen metabolism in M. mazei as well. In order to assign a function to M. mazei GlnK1 in nitrogen metabolism, a chromosomal glnK1 deletion mutant was constructed. Therefore genetic methods, e. g. effective plating and transformation protocols had to be established. M. mazei was finally genetical tractable by (i) selecting a potential spontaneous cell wall mutant of M. mazei that showed a higher plating efficiency and (ii) using the optimized liposome-mediated transformation protocol specifically developed for M. mazei strain Gö1. Growth experiments showed that under nitrogen limitation a partial reduced growth rate was observed in the mutant strain compared to the wild type. However, quantitative reverse transcription-PCR analysis of selected genes of the nitrogen regulon excluded a regulatory function of GlnK1 in transcriptional activation or repression.Biochemical experiments and in vivo data clearly demonstrated that GlnK1 interacts with glutamine synthetase (GlnA) thereby inhibiting its enzyme activity. In contrast, an activating effect on GlnA enzyme activity was observed in the presence of 2-oxoglutarate that reflects the internal nitrogen status of the cell. On the basis of these results we postulate following model: M. mazei perceives external nitrogen limitation by sensing the increase in the internal 2-oxoglutarate pool. Upon direct binding of 2-oxoglutarate, apparently resulting in a conformational change of GlnA, GlnA activity is highly stimulated and complex formation with GlnK1 is inhibited. After a shift to nitrogen sufficiency, however, the internal 2-oxoglutarate level decreases resulting in reduction of glutamine synthetase activity. It is therefore likely to propose that the nitrogen sensor GlnK1 allows fine tuning control of the glutamine synthetase activity under changing nitrogen availabilities.	de
dc.contributor.coReferee	Friedl, Thomas Prof. Dr.	de
dc.contributor.thirdReferee	Beese, Friedrich Prof. Dr.	de
dc.subject.topic	Mathematics and Computer Science	de
dc.subject.ger	Stickstoffregulation	de
dc.subject.ger	PII-Proteine	de
dc.subject.ger	GlnK	de
dc.subject.ger	Glutamin-Synthetase	de
dc.subject.eng	nitrogen regulation	de
dc.subject.eng	PII-like proteins	de
dc.subject.eng	GlnK	de
dc.subject.eng	glutamine synthetase	de
dc.subject.bk	42.30 Mikrobiologie	de
dc.identifier.urn	urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-144-5	de
dc.identifier.purl	webdoc-144	de
dc.affiliation.institute	Biologische Fakultät inkl. Psychologie	de
dc.subject.gokfull	WUZ 100Archaebakterien	de
dc.subject.gokfull	Archaea	de
dc.identifier.ppn	502623195	de

Files in this item

Name:ehlers.pdf

Size:1.577Mb

Format:PDF

Description:Dissertation

View/Open

Name:: ehlers.pdf
Size:: 1.577Mb
Format:: PDF
Description:: Dissertation

View/Open

This item appears in the following Collection(s)

Fakultät für Biologie und Psychologie (inkl. GAUSS) [1621]

Show simple item record