Ligand induzierte Phosphorylierung des Chemokin Rezeptors CCR5: strukturelle Analyse und Funktion
Ligand induced phosphorylation of CC-chemokine receptor CCR5: structural analysis and function
by Friederike Hüttenrauch
Date of Examination:2004-11-03
Date of issue:2005-09-26
Advisor:Prof. Dr. Martin Oppermann
Referee:Prof. Dr. Rüdiger Hardeland
Referee:Prof. Dr. Tomas Pieler
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
This study addresses the significance of the C-terminal phosphorylation sites of CC-chemokine receptor 5 (CCR5) for receptor regulation. β-Arrestin binding and rapid receptor internalization both require at least two C-terminal serine-phosphorylation sites whereby the exact position of these sites is not crucial. In contrast, receptor-desensitization depends on the exact positions of these serine-residues. This implies that CCR5 can be desensitized by β-Arrestin independent mechanisms. β-Arrestin also binds to the highly conserved DRY-motiv at the beginning of the second intracellular loop of CCR5. This motiv is not essentiell for β-Arrestin binding to the receptor but obviously triggers proper receptor activation resulting in β-Arrestin mediated receptor-internalization. Furthermore it was shown that CCR5 forms constitutive homodimers independent of ligand-activation of the receptor. Coexpression of two CCR5-mutants with different defects in receptor signalling restored the signalling-function of the receptor-dimer. This implicates that homodimers are regulated as a functional unit regarding signaltransduction. In addition to homodimerisation CCR5 also forms heterodimers with the related C5a-receptor (C5aR) but only to a small extent with the angiotensin receptor II type 1a (AT1aR). Coexpressing CCR5 together with C5aR or AT1aR lead to a significant CCR5-co-internalisation only after C5a-stimulation but not after stimulation with angiotensin. In addition CCR5 co-internalized in the absence of ligand when coexpressed with a constitutively internalising C5aR-US28-chimera. A phosphorylation-deficient C5aR-mutant that did not bind β-Arrestin was not able to co-internalize CCR5. These results imply a β-Arrestin/clathrin-mediated co-internalisation of CCR5. Cross-phosphorylation experiments revealed that after C5a-stimulation CCR5 is phosphorylated by protein kinase C (PKC) as well as by G protein-coupled receptor kinases (GRK). This is in contrast to the current model of heterologous receptor regulation proposed to be exclusively mediated by "second-messenger"-activated kinases like PKC and PKA. The results herein implicate that receptor-dimerization enables the heterologous GRK-mediated phosphorylation of unligated but complexed receptors within homo- or hetero-oligomeric protein complexes. Finally the significance of the receptor C-terminus for the regulation of receptor phosphorylation and β-Arrestin binding was examined. Therefore CCR5 and C5aR receptor chimeras were constructed where the C-termini of both receptors were interchanged. The results implicated that the time- and dose-dependent phosphorylation patterns were controlled predominantly by the corresponding C-terminus whereas the kinetic of β-Arrestin binding was predominantly determined by the N-terminus of the receptor.
Keywords: CCR5 β-Arrestin receptor dimer
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In dieser Arbeit wurde die Bedeutung der C-terminalen Phosphorylierungsstellen des CC-Chemokin Rezeptors 5 (CCR5) für die Rezeptorregulation untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß sowohl für die β-Arrestin-Bindung als auch für die schnelle Rezeptorinternalisierung wenigstens zwei C-terminale Serin-Phosphorylierungsstellen vorhanden sein müssen, wobei die exakte Position dieser zwei Serine unerheblich ist. Für die Rezeptordesensibilisierung dagegen ist die genaue Position dieser Serine bestimmend. Dies impliziert, daß CCR5 auch über β-Arrestin-unabhängige Mechanismen desensibilisiert werden kann. β-Arrestin bindet außerdem an das in GPCRs hoch konservierte DRY-Motiv am Beginn der zweiten intrazellulären Schleife von CCR5. Dieses Motiv ist nicht essenziell für die Bindung von β-Arrestin an CCR5, vermittelt aber offensichtlich die korrekte Rezeptoraktivierung, die in der β-Arrestin-vermittelten Internalisierung des Rezeptors resultiert. Es konnte weiterhin gezeigt werden, daß CCR5 bereits unter basalen, nicht Ligand-aktivierten Bedingungen Homodimere bildet. Durch Coexpression zweier CCR5-Mutanten mit unterschiedlichen Defekten in ihrer Rezeptoraktivierbarkeit konnte die Funktion beider Rezeptoren wieder hergestellt werden. Daher läßt sich postulieren, daß Homodimere in der Signaltransduktion vermutlich als eine funktionelle Einheit reguliert werden. CCR5 bildet neben Homodimeren auch Heterodimere mit dem C5a Rezeptor (C5aR) und zu einem geringeren Maße mit dem Angiotensin Rezeptor II Typ 1a (AT1aR). Durch Coexpression von CCR5 mit C5aR oder AT1aR konnte eine signifikante CCR5-Cointernalisierung nach heterologer C5a-Stimulation beobachtet werden, die bei heterologer Angiotensin-Stimulation deutlich geringer ausfiel. Weiterhin zeigte CCR5 bei Coexpression mit einer konstitutiv internalisierenden C5aR-US28-Chimäre eine Ligand unabhängige Cointernalisierung. Eine phosphorylierungsdefiziente C5aR-Mutante, die nicht in der Lage war, β-Arrestin zu binden, konnte CCR5 nicht cointernalisieren. Damit weisen die Ergebnisse auf einen β-Arrestin/Clathrin-vermittelten Cointernalisierungsweg für CCR5 hin. In Cophosphorylierungs-experimenten konnte gezeigt werden, daß CCR5 nach heterologer C5a-Stimulation sowohl durch Protein Kinase C (PKC) als auch durch G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinasen (GRKs) phosphoryliert wird. Der Nachweis der Phosphorylierung nicht Ligand-gebundener Rezeptoren durch GRKs widerlegt das bisher gültige Konzept der heterologen Rezeptorregulation ausschließlich durch second-messenger -aktivierte Kinasen wie PKC und PKA. Es kann postuliert werden, daß die Rezeptor-Dimerisierung die heterologe, GRK-vermittelte Phosphorylierung nicht Ligand-gebundener aber komplexierter Rezeptoren ermöglicht. Schließlich wurde die Bedeutung des Rezeptor-C-Terminus für die Regulation der Phosphorylierung und β-Arrestin-Bindung von GPCRs untersucht. Dazu wurden Rezeptorchimären aus CCR5 und C5aR hergestellt, in denen die C-Termini beider Rezeptoren untereinander ausgetauscht wurden. Die Untersuchungen zeigten, daß die zeit- und konzentrationsabhängigen Phosphorylierungsmuster zusammen mit dem C-Terminus auf den jeweils anderen Rezeptor übertragen wurden. Die Kinetik der β-Arrestin-Translokation wurde dagegen nicht zusammen mit dem C-Terminus übertragen, sondern blieb vom N-terminalen Rezeptorbereich determiniert.
Schlagwörter: CCR5 β-Arrestin Rezeptor Dimer