Ligand induzierte Phosphorylierung des Chemokin Rezeptors CCR5: strukturelle Analyse und Funktion

Abstract

In dieser Arbeit wurde die Bedeutung der C-terminalen Phosphorylierungsstellen des CC-Chemokin Rezeptors 5 (CCR5) für die Rezeptorregulation untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß sowohl für die β-Arrestin-Bindung als auch für die schnelle Rezeptorinternalisierung wenigstens zwei C-terminale Serin-Phosphorylierungsstellen vorhanden sein müssen, wobei die exakte Position dieser zwei Serine unerheblich ist. Für die Rezeptordesensibilisierung dagegen ist die genaue Position dieser Serine bestimmend. Dies impliziert, daß CCR5 auch über β-Arrestin-unabhängige Mechanismen desensibilisiert werden kann. β-Arrestin bindet außerdem an das in GPCRs hoch konservierte DRY-Motiv am Beginn der zweiten intrazellulären Schleife von CCR5. Dieses Motiv ist nicht essenziell für die Bindung von β-Arrestin an CCR5, vermittelt aber offensichtlich die korrekte Rezeptoraktivierung, die in der β-Arrestin-vermittelten Internalisierung des Rezeptors resultiert. Es konnte weiterhin gezeigt werden, daß CCR5 bereits unter basalen, nicht Ligand-aktivierten Bedingungen Homodimere bildet. Durch Coexpression zweier CCR5-Mutanten mit unterschiedlichen Defekten in ihrer Rezeptoraktivierbarkeit konnte die Funktion beider Rezeptoren wieder hergestellt werden. Daher läßt sich postulieren, daß Homodimere in der Signaltransduktion vermutlich als eine funktionelle Einheit reguliert werden. CCR5 bildet neben Homodimeren auch Heterodimere mit dem C5a Rezeptor (C5aR) und zu einem geringeren Maße mit dem Angiotensin Rezeptor II Typ 1a (AT1aR). Durch Coexpression von CCR5 mit C5aR oder AT1aR konnte eine signifikante CCR5-Cointernalisierung nach heterologer C5a-Stimulation beobachtet werden, die bei heterologer Angiotensin-Stimulation deutlich geringer ausfiel. Weiterhin zeigte CCR5 bei Coexpression mit einer konstitutiv internalisierenden C5aR-US28-Chimäre eine Ligand unabhängige Cointernalisierung. Eine phosphorylierungsdefiziente C5aR-Mutante, die nicht in der Lage war, β-Arrestin zu binden, konnte CCR5 nicht cointernalisieren. Damit weisen die Ergebnisse auf einen β-Arrestin/Clathrin-vermittelten Cointernalisierungsweg für CCR5 hin. In Cophosphorylierungs-experimenten konnte gezeigt werden, daß CCR5 nach heterologer C5a-Stimulation sowohl durch Protein Kinase C (PKC) als auch durch G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinasen (GRKs) phosphoryliert wird. Der Nachweis der Phosphorylierung nicht Ligand-gebundener Rezeptoren durch GRKs widerlegt das bisher gültige Konzept der heterologen Rezeptorregulation ausschließlich durch second-messenger -aktivierte Kinasen wie PKC und PKA. Es kann postuliert werden, daß die Rezeptor-Dimerisierung die heterologe, GRK-vermittelte Phosphorylierung nicht Ligand-gebundener aber komplexierter Rezeptoren ermöglicht. Schließlich wurde die Bedeutung des Rezeptor-C-Terminus für die Regulation der Phosphorylierung und β-Arrestin-Bindung von GPCRs untersucht. Dazu wurden Rezeptorchimären aus CCR5 und C5aR hergestellt, in denen die C-Termini beider Rezeptoren untereinander ausgetauscht wurden. Die Untersuchungen zeigten, daß die zeit- und konzentrationsabhängigen Phosphorylierungsmuster zusammen mit dem C-Terminus auf den jeweils anderen Rezeptor übertragen wurden. Die Kinetik der β-Arrestin-Translokation wurde dagegen nicht zusammen mit dem C-Terminus übertragen, sondern blieb vom N-terminalen Rezeptorbereich determiniert.