Isolation and Characterization of Human Precatalytic Spliceosomal B Complexes
Isolierung und Charakterisierung des humanen präkatalytischen spleißosomalen B Komplexes
von Jochen Deckert
Datum der mündl. Prüfung:2007-01-18
Erschienen:2007-04-26
Betreuer:Prof. Dr. Reinhard Lührmann
Gutachter:Prof. Dr. Hans-Joachim Fritz
Gutachter:Prof. Dr. Tomas Pieler
Dateien
Name:deckert.pdf
Size:5.29Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
The spliceosomal B complex is the substrate that undergoes catalytic activation leading to catalysis of pre-mRNA splicing. Previous characterization of this complex was performed in the presence of heparin, which dissociates less stably-associated components. To obtain a more comprehensive inventory of the B complex proteome, we isolated this complex under low stringency conditions using two independent methods. For both procedures, RNA aptamers, namely the MS2 coat protein RNA binding sequence or the tobramycin RNA aptamer sequence, were inserted into the pre-mRNA to provide a tag on the RNA for affinity selections. The first procedure then combines density gradient centrifugation followed by maltose binding protein (fused to MS2 coat protein) affinity selection whereas the second procedure makes use of the tobramycin affinity selection procedure followed by immunoaffinity selection. In both cases, isolated complexes contained stoichiometric amounts of unspliced pre-mRNA and the U1, U2, U4, U5 and U6 snRNAs. MS2 affinity-selected B complexes supported splicing when incubated in nuclear extract depleted of snRNPs. Mass spectrometry identified over 110 proteins in both independently purified B complex preparations, including ~50 non-snRNP proteins not previously found in the spliceosomal A complex. Unexpectedly, the heteromeric hPrp19/CDC5 complex and 10 additional hPrp19/CDC5-related proteins were detected, indicating they are recruited prior to spliceosome activation. Structural analysis by cryo-electron microscopy revealed that MS2 affinity-selected B complexes exhibit a rhombic shape with a maximum dimension of 420 Å and are structurally more homogeneous than B complexes treated with heparin. These data provide novel insights into the composition and structure of the spliceosome just prior to its catalytic activation and suggest a potential role in activation for proteins recruited at this stage. Furthermore, the spliceosomal complexes isolated here are well-suited for complementation studies with purified proteins to dissect factor requirements for spliceosome activation and splicing catalysis.>/p>
Keywords: pre-mRNA; spliceosomal B complex
Weitere Sprachen
Die katalytische Aktivierung des spleißosomalen B Komplexes ist eine mechanistische Voraussetzung für den Vorgang des Prä-mRNA Spleißens. Bisherige Untersuchungen dieses Komplexes wurden in Anwesenheit von Heparin durchgeführt, wodurch weniger stabil assoziierte Faktoren bei der Komplexisolierung verlorengehen. Zur Ermittlung der Protein-Zusammensetzung des B Komplexes unter milden, nativen Bedingungen, wurde dieser mittels zweier verschiedener Methoden isoliert. In beiden Fällen wurden RNA Bindungssequenzen für das MS2-Hüllprotein oder das Aminoglykosid Tobramycin in das Prä-mRNA Substrat eingefügt, die eine Markierung der RNA für Affinitätsselektionen bereitstellten. Die erste Prozedur kombiniert Dichtegradientenzentrifugation und Affinitätsselektion mittels Maltose-bindendem Protein (fusioniert mit MS2 Hüllprotein), wogegen das zweite Isolierungsverfahren sich der Tobramycin Affinitätsselektion, gefolgt von Immunaffinitätsselektion, bedient. In beiden Fällen enthielten die isolierten Komplexe stöchiometrische Mengen von nicht-gespleißter Prä-mRNA und die U1, U2, U4, U5 sowie U6 snRNAs. Die MS2 affinitätsgereinigten B Komplexe sind funktionell aktivierbar und durchlaufen beide Spleißschritte nach einer Inkubation in Kernextrakt, welcher zuvor von jeglichen snRNPs depletiert wurde. Eine massenspektrometrische Analyse identifizierte mehr als 110 Proteine in beiden unabhängigen B Komplex Präparationen, einschließlich ~50 nicht-snRNP spezifischer Faktoren, die zuvor nicht im spleißosomalen A Komplex zu detektieren waren. Überraschenderweise konnten ebenfalls Komponenten des heteromeren hPrp19/CDC5 Komplexes und 10 zusätzliche hPrp19/CDC5 assoziierte Faktoren identifiziert werden. Dies deutet darauf hin, dass diese Proteine bereits vor der Aktivierung des Spleißosoms rekrutiert werden. Eine strukturelle Analyse der MS2 affinitätsgereinigten B Komplexe mittels Cryo-Elektronenmikroskopie zeigte eine rhombische Gestalt mit einem maximalen Durchmesser von 420 Å. Des weiteren wiesen die hier aufgereinigten B Komplexe eine größere strukturelle Homogenität im Vergleich zu mit Heparin behandelten Komplexen auf. Die hier dargestellten Daten liefern neue Erkenntnisse zur Proteinzusammensetzung und Struktur von nativ isolierten Spleißosomen vor deren katalytischer Aktivierung. Proteine, welche an dieser Stelle rekruiert werden, sind möglicherweise an dem Aktivierungsschritt beteiligt. Die so aufgereinigten spleißosomalen Komplexe sind weiterhin hervorragend geeignet zur Identifizierung und Untersuchung von Faktoren, die für die Aktivierung des B Komplexes und die Katalyseschritte der Spleißreaktion notwendig sind.
Schlagwörter: prä-mRNA; spleißosomaler B Komplex