Isolation and Characterization of Human Precatalytic Spliceosomal B Complexes

Abstract

Die katalytische Aktivierung des spleißosomalen B Komplexes ist eine mechanistische Voraussetzung für den Vorgang des Prä-mRNA Spleißens. Bisherige Untersuchungen dieses Komplexes wurden in Anwesenheit von Heparin durchgeführt, wodurch weniger stabil assoziierte Faktoren bei der Komplexisolierung verlorengehen. Zur Ermittlung der Protein-Zusammensetzung des B Komplexes unter milden, nativen Bedingungen, wurde dieser mittels zweier verschiedener Methoden isoliert. In beiden Fällen wurden RNA Bindungssequenzen für das MS2-Hüllprotein oder das Aminoglykosid Tobramycin in das Prä-mRNA Substrat eingefügt, die eine Markierung der RNA für Affinitätsselektionen bereitstellten. Die erste Prozedur kombiniert Dichtegradientenzentrifugation und Affinitätsselektion mittels Maltose-bindendem Protein (fusioniert mit MS2 Hüllprotein), wogegen das zweite Isolierungsverfahren sich der Tobramycin Affinitätsselektion, gefolgt von Immunaffinitätsselektion, bedient. In beiden Fällen enthielten die isolierten Komplexe stöchiometrische Mengen von nicht-gespleißter Prä-mRNA und die U1, U2, U4, U5 sowie U6 snRNAs. Die MS2 affinitätsgereinigten B Komplexe sind funktionell aktivierbar und durchlaufen beide Spleißschritte nach einer Inkubation in Kernextrakt, welcher zuvor von jeglichen snRNPs depletiert wurde. Eine massenspektrometrische Analyse identifizierte mehr als 110 Proteine in beiden unabhängigen B Komplex Präparationen, einschließlich ~50 nicht-snRNP spezifischer Faktoren, die zuvor nicht im spleißosomalen A Komplex zu detektieren waren. Überraschenderweise konnten ebenfalls Komponenten des heteromeren hPrp19/CDC5 Komplexes und 10 zusätzliche hPrp19/CDC5 assoziierte Faktoren identifiziert werden. Dies deutet darauf hin, dass diese Proteine bereits vor der Aktivierung des Spleißosoms rekrutiert werden. Eine strukturelle Analyse der MS2 affinitätsgereinigten B Komplexe mittels Cryo-Elektronenmikroskopie zeigte eine rhombische Gestalt mit einem maximalen Durchmesser von 420 Å. Des weiteren wiesen die hier aufgereinigten B Komplexe eine größere strukturelle Homogenität im Vergleich zu mit Heparin behandelten Komplexen auf. Die hier dargestellten Daten liefern neue Erkenntnisse zur Proteinzusammensetzung und Struktur von nativ isolierten Spleißosomen vor deren katalytischer Aktivierung. Proteine, welche an dieser Stelle rekruiert werden, sind möglicherweise an dem Aktivierungsschritt beteiligt. Die so aufgereinigten spleißosomalen Komplexe sind weiterhin hervorragend geeignet zur Identifizierung und Untersuchung von Faktoren, die für die Aktivierung des B Komplexes und die Katalyseschritte der Spleißreaktion notwendig sind.