Creation and establishment of transgenic mouse models for for Mecp2 gene, causing Rett syndrome
Kreation und Einrichtung der transgenic Maus modelliert für Mecp2, verursacht Rett Syndrom
by Jayamuruga Pandian Arunachalam
Date of Examination:2007-05-03
Date of issue:2007-05-08
Advisor:PD Dr. Franco Laccone
Referee:Prof. Dr. Wolfgang Engel
Referee:PD Dr. Sigrid Hoyer-Fender
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-205
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Format:PDF
Description:Dissertation
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Abstract
English
The MeCP2 protein is a transcriptional repressor binding to methylated cytosines and modifying the chromatin structure. Mecp2 gene was eventually found to be the cause of 95% of Rett Syndrome cases. In spite of its ubiquitous expression, it is believed to have some unique functions in the neurons. But till now, very less is known about the role of MeCP2 in neuronal cells and the mechanism by which it brings about the deteriorating disorder. The aim of the project was to produce two different transgenic mouse models expressing Mecp2 tagged with EGFP as a reporter to further characterize Mecp2 and obtain an appropriate functional analysis. The transgenic constructs have been generated by engineering a BAC clone (B22804) containing the entire Mecp2 gene of the mouse and flanking sequences, by GET recombination. First mouse model overexpresses the wild type Mecp2 labeled at C-terminus with EGFP protein. The second transgenic model overexpresses an early truncated (human mutation) Mecp2 protein, lacking the nuclear localization signal, also labeled at the C-terminus with the EGFP protein. The investigation of the transgenic mouse lines shall allow the spatio-temporal analysis of the Mecp2 protein by tracing the EGFP protein. Moreover, the transgenic mouse model which ectopically expresses an early truncated Mecp2 protein will help to understand the role of the mutated protein in the pathogenesis of the Rett Syndrome. Although Mecp2 is more predominantly expressed in the brain, it doesn"t seem to express in all the cells including glial cells. So, the Mecp2+/EGFP+ specific brain cells were isolated by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) using our unique transgenic mouse models and the identity of them could be characterized using different markers by immunostaining. A transcriptomics approach using the Mecp2+/EGFP+ cell sub-population between the two transgenic models would validate the regulation of already found target genes or determine new target genes specifically. Further analysis will be done in the following directions: Live cell imaging of Mecp2 at the synapses, analysis of Mecp2+/EGFP+ cells in the respiratory network through the mouse development, and determining the size of the neurons expressing the transgenic proteins.
Keywords: Mecp2; Rett Syndrome; transgenic; EGFP; GET recombination
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Das MeCP2 Protein ist ein transkriptonaler Repressor, der an methylierte Cytosine bindet und die Chromatinstruktur modifiziert. Mecp2 ist für 95% aller Rett-Syndrom-Fälle verantwortlich. Trotz der ubiquitären Expression von MeCP2 wird angenommen, dass es einzigartige Funktionen in Neuronen hat. Aber bis heute ist wenig bekannt über die genaue Rolle von MeCP2 in neuronalen Zellen und über den Mechanismus, durch den die Krankheit ausgelöst wird. Das Ziel dieser Arbeit war es, zwei transgene Mausmodelle zu generieren, die Mecp2 gekoppelt an EGFP als Reporter exprimieren. Dadurch erhofften wir uns eine genauere Charakterisierung von Mecp2 und eine angemessene funktionelle Analyse durchführen zu können. Das transgene Konstrukt wurde durch GET Rekombination eines BAC-Klones (B22804) hergestellt, der das gesamte Mecp2 -Gen der Maus mit flankierenden Sequenzen enthält. Das erste Mausmodell überexprimiert das Wildtyp Mecp2, welches mit EGFP am C-Terminus gekoppelt ist. Das zweite transgene Mausmodell überexprimiert eine verkürzte Form (eine bekannte humane Mutation) des Mecp2 Proteins, welchem das Kernlokalisierungssignal fehlt, und ebenfalls am C-Terminus mit EGFP gekoppelt ist. Die Untersuchung der transgenen Linien erlaubt eine zeitlich-räumliche Analyse des MeCP2-Proteins über das EGFP-Signal. Ausserdem sollte das transgene Mausmodell, welches die verkürzte Form des Proteins exprimiert, helfen, die Rolle des mutierten MeCP2 in der Pathogenese des Rett-Syndroms zu verstehen. Obwohl MeCP2 vorwiegend im Gehirn exprimiert wird, scheint es nicht in allen Zellen, inclusive der Gliazellen, exprimiert zu werden. Also wurden die Mecp2+/EGFP+ exprimierenden Gehirnzellen durch FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) isoliert und weiter über Immunfärbungen konnte mit verschiedenen Markern charakterisiert. Ein Ansatz über Transcriptomics mit Mecp2+/EGFP+ Zellpopulationen beider transgener Linien könnte die Regulation von bekannten Zielgenen bestätigen oder neue Zielgene identifizieren. Weitere Analysen die gemacht werden sollen, sind unter anderem Live cell imaging von Mecp2 Synapsen, die Analyse von Mecp2+/EGFP+ Zellen im respiratorischen Netzwerk während der Mausentwicklung und die Bestimmung der Größe der Neuronen, die das transgene Protein exprimieren.
Schlagwörter: Mecp2; das Rett Syndrom; transgene; EGFP; GET Rekombination
