Molekulare Mechanismen der Regulation der Glukagon-Gentranskription durch die Pax6-Homöodomäne
Molecular mechanisms of the regulation of the glucagon gene transcription by the Pax6 homeodomain
by Marcel Grapp
Date of Examination:2007-05-11
Date of issue:2007-06-05
Advisor:Prof. Dr. Willhart Knepel
Referee:Prof. Dr. Rüdiger Hardeland
Referee:PD Dr. Wilfried Kramer
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
The peptide hormone glucagon increases glucose output from the liver and thus maintains sufficient blood glucose levels during the fasting state. Malfunctions in biosynthesis and secretion of glucagon contribute to the pathogenesis of diabetes type 2. The cell-specific activation of the glucagon gene in the a-cells of pancreatic islets is caused by multiple transcription factors among those Pax6 seems to be crucial. Pax6 binds in vitro through its paired domain to the PISCES-motif, present in the proximal promoter element G1 and the more distal enhancer like element G3 of the glucagon gene promoter and activates the glucagon gene transcription synergistically. In addition, Pax6 contains a homeodomain as a second DNA binding domain whose function is unclear. Previous studies revealed that the Pax6 homeodomain contributes to the activation of glucagon gene transcription but the mechanism is still unclear. The aim of this work was to investigate the molecular mechanisms of the Pax6 homeodomain acting on the regulation of glucagon gene transcription. Alignment of DNA sequences revealed a putative Pax6 homeodomain binding site in the G1 and G3 element adjacent directly and in reverse orientation to the region 5´ to the PISCES-motif, suggesting a so called PH0-like binding of Pax6 to the glucagon gene promoter. In this putative Pax6 homeodomain binding site, two central base pairs in G1 and G3 were mutated (PH0mut1). Using deletion mutants of the Pax6 protein (produced by in vitro transcription/translation or by the baculovirus expression system) it was shown by electrophoretic mobility shift assays, that the paired domain is sufficient for the interaction with the G3 element, whereas the binding to G1 requires the linker region and the homeodomain in addition. The mutation PH0mut1 had no effect on the binding of Pax6 wildtyp and the Pax6 paired domain to G3, but decreased the binding of Pax6 wildtyp to G1 dramatically. In transient transfections with reporter fusion genes it was shown, that the mutation PH0mut1 in G1 decreased the activation of the glucagon gene promoter by endogenous Pax6 in the a-cell line InR1G9. Likewise the mutation PH0mut1 in G3 reduced the activation of the glucagon gene in InR1G9 cells as well as in the heterologous cell line JEG-3 by expression of Pax6. Furthermore, it was shown that the Pax6 linker region is essential for the function of Pax6 in the activation of the glucagon gene. A conserved region of twelve amino acids in the linker located N-terminally to the homeodomain was identified as an important sequence for DNA-binding and function of Pax6. These results suggest a PH0-like binding of the Pax6 homeodomain to the elements G1 and G3 of the glucagon gene promoter. Noteworthy, the cooperative binding of the Pax6 homeodomain is even necessary for the activation of transcription on the G3 element, although the homeodomain does not contribute to the binding of Pax6 to G3. A model assumes that the cooperative binding of the Pax6 homeodomain and the Pax6 paired domain to G1 and G3 induces a conformational change of the Pax6 protein resulting in an increased glucagon gene transcription.
Keywords: Pax6; homeodomain; paired domain; glucagon; transcription factor; DNA binding
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Das Peptidhormon Glukagon erhöht die Glukoseabgabe aus der Leber und ist damit für die Aufrechterhaltung ausreichender Blutzuckerspiegel während der Hungerphase notwendig. Störungen in der Glukagon-Biosynthese und -Sekretion tragen zur Pathogenese des Diabetes mellitus bei, der sich durch hyperglykämische Zustände äußert. Die zellspezifische und nahrungsabhängige Aktivierung des Glukagon-Gens in den a-Zellen der Langerhans´schen Inseln des Pankreas wird auf transkriptionellem Niveau reguliert, wobei der Transkriptionsfaktor Pax6 eine essentielle Rolle spielt. Pax6 bindet in vitro über seine Paired-Domäne an das PISCES-Motiv im G1- und G3-Element des Glukagon-Genpromotors und aktiviert synergistisch die Transkription des Glukagon-Gens. Pax6 besitzt noch eine weitere DNA-Bindedomäne, die Homöodomäne, deren Funktion weitgehend unbekannt ist. Vorangegangene Untersuchungen in der Arbeitsgruppe hatten durch interne Deletion und gezielte Mutation der Pax6-Homöodomäne zeigen können, dass die Pax6-Homöodomäne für die Aktivierung des Glukagon-Gens durch Pax6 notwendig ist, vermutlich durch Bindung an das G3- und G1-Element. Wo und wie diese Bindung erfolgt, blieb unbekannt. Die vorliegende Arbeit sollte zum besseren Verständnis der molekularen Mechanismen der Regulation der Glukagon-Gentranskription durch die Pax6-Homöodomäne beitragen. Durch DNA-Sequenzvergleiche konnte im G1- und G3-Element des Glukagon-Promotors eine putative Pax6-Homöodomänen-Bindungsstelle in reverser Orientierung und direkt angrenzend im 5´-Bereich des PISCES-Motivs (PH0) identifiziert werden. Zwei zentrale Basen der putativen Pax6-Homöodomänen-Bindungsstelle wurden in G3 bzw. G1 mutiert (PH0mut1). Mit Hilfe von durch in vitro Transkription/Translation oder im Baculovirussystem hergestellten Proteinen konnte im Electrophoretic Mobility Shift Assay bestätigt werden, dass die Pax6-Paired-Domäne für die Bindung an das G3-Element ausreichend ist, wohingegen für die Bindung an das G1-Element die Pax6-Paired-Domäne mit Linker und Homöodomäne notwendig ist. Die Mutation PH0mut1 hatte keine Wirkung auf die Bindung von Pax6-Wildtyp und Pax6-Paired-Domäne an G3, verminderte jedoch massiv die Bindung von Pax6-Wildtyp an G1. In transienten Transfektionsstudien mit Reporterfusionsgenen verminderte die Mutation PH0mut1 drastisch die transkriptionelle Aktivierung am G1-Element durch endogenes Pax6 in der a-Zelllinie InR1G9. Ebenso verminderte die Mutation PH0mut1 stark die transkriptionelle Aktivierung am G3-Element durch endogenes Pax6 in der a-Zelllinie InR1G9 oder durch exprimiertes Pax6 in der heterologen Zelllinie JEG-3. Durch Mutationsstudien der Pax6-Linkerregion konnte demonstriert werden, dass der Linker notwendig für Aktivierung des Glukagon-Gens durch Pax6 ist. Ein entscheidender Beitrag kommt dabei einer 12 Aminosäure-langen konservierten Region N-terminal der Pax6-Homöodomäne zu, die möglicherweise durch Protein-Protein-Interaktionen mit N-terminalen Bereichen der Pax6-Paired-Domäne zu der kooperativen Bindung beider DNA-Bindedomänen am Glukagon-Genpromotor beiträgt. Diese Befunde sprechen für eine PH0-artige Bindung der Pax6-Homöodomäne an das G3- und G1-Element des Glukagon-Gens. Bemerkenswerterweise ist diese kooperative Bindung der Pax6-Homöodomäne für die Aktivierung der Transkription auch dort (an G3) notwendig, wo die Bindung der Pax6-Homöodomäne nicht zur Gesamtaffinität der Bindung von Pax6 beiträgt. Es wird daher postuliert, dass die kooperative Bindung der Pax6-Homöodomäne mit der Pax6-Paired-Domäne sowohl am G1- als auch G3-Element des Glukagon-Gens eine Neufaltung von Pax6 in eine transkriptionell aktive Konformation induziert.
Schlagwörter: Pax6; Homöodomäne; Paired-Domäne; Glukagon; Transkriptionsfaktor; DNA-Bindung