Molekulare Mechanismen der Regulation der Glukagon-Gentranskription durch die Pax6-Homöodomäne

Abstract

Das Peptidhormon Glukagon erhöht die Glukoseabgabe aus der Leber und ist damit für die Aufrechterhaltung ausreichender Blutzuckerspiegel während der Hungerphase notwendig. Störungen in der Glukagon-Biosynthese und -Sekretion tragen zur Pathogenese des Diabetes mellitus bei, der sich durch hyperglykämische Zustände äußert. Die zellspezifische und nahrungsabhängige Aktivierung des Glukagon-Gens in den a-Zellen der Langerhans´schen Inseln des Pankreas wird auf transkriptionellem Niveau reguliert, wobei der Transkriptionsfaktor Pax6 eine essentielle Rolle spielt. Pax6 bindet in vitro über seine Paired-Domäne an das PISCES-Motiv im G1- und G3-Element des Glukagon-Genpromotors und aktiviert synergistisch die Transkription des Glukagon-Gens. Pax6 besitzt noch eine weitere DNA-Bindedomäne, die Homöodomäne, deren Funktion weitgehend unbekannt ist. Vorangegangene Untersuchungen in der Arbeitsgruppe hatten durch interne Deletion und gezielte Mutation der Pax6-Homöodomäne zeigen können, dass die Pax6-Homöodomäne für die Aktivierung des Glukagon-Gens durch Pax6 notwendig ist, vermutlich durch Bindung an das G3- und G1-Element. Wo und wie diese Bindung erfolgt, blieb unbekannt. Die vorliegende Arbeit sollte zum besseren Verständnis der molekularen Mechanismen der Regulation der Glukagon-Gentranskription durch die Pax6-Homöodomäne beitragen. Durch DNA-Sequenzvergleiche konnte im G1- und G3-Element des Glukagon-Promotors eine putative Pax6-Homöodomänen-Bindungsstelle in reverser Orientierung und direkt angrenzend im 5´-Bereich des PISCES-Motivs (PH0) identifiziert werden. Zwei zentrale Basen der putativen Pax6-Homöodomänen-Bindungsstelle wurden in G3 bzw. G1 mutiert (PH0mut1). Mit Hilfe von durch in vitro Transkription/Translation oder im Baculovirussystem hergestellten Proteinen konnte im Electrophoretic Mobility Shift Assay bestätigt werden, dass die Pax6-Paired-Domäne für die Bindung an das G3-Element ausreichend ist, wohingegen für die Bindung an das G1-Element die Pax6-Paired-Domäne mit Linker und Homöodomäne notwendig ist. Die Mutation PH0mut1 hatte keine Wirkung auf die Bindung von Pax6-Wildtyp und Pax6-Paired-Domäne an G3, verminderte jedoch massiv die Bindung von Pax6-Wildtyp an G1. In transienten Transfektionsstudien mit Reporterfusionsgenen verminderte die Mutation PH0mut1 drastisch die transkriptionelle Aktivierung am G1-Element durch endogenes Pax6 in der a-Zelllinie InR1G9. Ebenso verminderte die Mutation PH0mut1 stark die transkriptionelle Aktivierung am G3-Element durch endogenes Pax6 in der a-Zelllinie InR1G9 oder durch exprimiertes Pax6 in der heterologen Zelllinie JEG-3. Durch Mutationsstudien der Pax6-Linkerregion konnte demonstriert werden, dass der Linker notwendig für Aktivierung des Glukagon-Gens durch Pax6 ist. Ein entscheidender Beitrag kommt dabei einer 12 Aminosäure-langen konservierten Region N-terminal der Pax6-Homöodomäne zu, die möglicherweise durch Protein-Protein-Interaktionen mit N-terminalen Bereichen der Pax6-Paired-Domäne zu der kooperativen Bindung beider DNA-Bindedomänen am Glukagon-Genpromotor beiträgt. Diese Befunde sprechen für eine PH0-artige Bindung der Pax6-Homöodomäne an das G3- und G1-Element des Glukagon-Gens. Bemerkenswerterweise ist diese kooperative Bindung der Pax6-Homöodomäne für die Aktivierung der Transkription auch dort (an G3) notwendig, wo die Bindung der Pax6-Homöodomäne nicht zur Gesamtaffinität der Bindung von Pax6 beiträgt. Es wird daher postuliert, dass die kooperative Bindung der Pax6-Homöodomäne mit der Pax6-Paired-Domäne sowohl am G1- als auch G3-Element des Glukagon-Gens eine Neufaltung von Pax6 in eine transkriptionell aktive Konformation induziert.