Versuche zur Strukturaufklärung bakterieller Thiouridin Synthetasen
Crystallization and structure determination attempts with bacterial thiouridine synthetases
by Peter-Thomas Naumann
Date of Examination:2006-01-18
Date of issue:2006-06-02
Advisor:Prof. Dr. Ralf Ficner
Referee:PD Dr. Michael Hoppert
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
The tRNA of most organisms is postranscriptionally modified. The sulfurtransferases ThiI and MnmA modify tRNAs by the incorporation of sulfur. In archaea and bacteria two different roles of ThiI were observed. On the one hand it is involved in the biosynthesis of thiamine and on the other hand it is involved in the modification of tRNA. Here it modifies uridine at position 8 of most tRNAs from archaea and bacteria by substituting oxygen at position 4 of its C-ring against sulfur. The resulting 4thiouridine serves as an important part of a UV sensoring system that was observed in Escherichia coli and Salmonella enterica serovar typhimurium. The enzyme MnmA substitutes oxygen at C2 of uridine at position 34 of the tRNA against sulfur leading to 2thiouridine. Afterwards 2thiouridine is further modified to methylaminomethyl-2thiouridine, a modification that is found in the tRNAs for glutamine, glutamate and lysine in archaea, bacteria and eukaryotes. It suppresses the wobble problem.The genes of ThiI and MnmA from Escherichia coli and the hyperthermophilic Thermotoga maritima were cloned and overexpressed for crystallization attempts. It was possible to establish purification protocols. Since no crystals were obtained of the pure proteins it was possible to constitute a complex of ThiI from Thermotoga maritima with its minimal substrate (39-mer tRNAPhe). After the crystallization of the complex the crystals were used for preliminary crystallographic studies.
Keywords: 4-thiouridine; ThiI; 2-thiouridine; MnmA; tRNA; tRNA-modification; protein crystallography; <i>Thermotoga maritima</i>
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Von nahezu allen rezenten Organismen ist bekannt, dass ihre tRNA posttrans-kriptional modifiziert wird. Ein Beispiel für diese Modifikationen ist die Insertion von Schwefel, wie sie durch die beiden Sulfurtransferasen ThiI und MnmA katalysiert wird. ThiI katalysiert die Insertion von Schwefel an Position 8 der tRNA. Hier wird Sauerstoff am C4-Atom des Uridins mit Hilfe des Enzyms IscS durch Schwefel substituiert. Das so entstandene 4Thiouridin kann in den meisten tRNAs aus Archaea und Bakterien gefunden werden und ist ein wichtiger Bestandteil eines in Escherichia coli und Salmonella enterica serovar typhimurium nachgewiesenen UV-Schutzmechanismusses. Zusätzlich konnte eine Beteiligung von ThiI an der Thiaminbiosynthese nachgewiesen werden. Die tRNA Modifikation durch MnmA erfolgt ebenfalls über IscS. Jedoch wird hier Sauerstoff am C2-Atom des Uridins an Position 34 der tRNA substituiert. Das so entstandene 2Thiouridin wird weiter zu Methylaminomethyl-2Thiouridin modifiziert, das in den tRNAs für Glutamin, Glutamat und Lysin in Archaea, Bakterien und Eukaryoten gefunden werden kann. Es unterdrückt das sog. Wobble-Problem.Die Struktur von ThiI und MnmA aus Escherichia coli und dem Hyperthermophilen Thermotoga maritima sollte aufgeklärt werden. Dazu wurden die entsprechenden Gene in Escherichia coli kloniert und exprimiert. Es war möglich, Aufreinigungs-protokolle für die verschiedenen Proteine zu etablieren. Bei den nachfolgenden Kristallisationsversuchen wurden jedoch keine zur Strukturaufklärung geeigneten Kristalle erhalten. Im Zuge der Arbeiten gelang es dann aber einen Komplex von ThiI aus Thermotoga maritima und einer verkürzten tRNA (39-mer tRNAPhe, einem Minimalsubstrat der Enzymkatalyse) zu generieren und zu kristallisieren. Die so erhaltenen Kristalle wurden zu röntgenkristallographischen Studien heranzogen.
Schlagwörter: 4-Thiouridin; ThiI; 2-Thiouridin; MnmA; tRNA; tRNA-Modifikation; Protein Kristallographie; <i>Thermotoga maritima</i>