Versuche zur Strukturaufklärung bakterieller Thiouridin Synthetasen

Abstract

Von nahezu allen rezenten Organismen ist bekannt, dass ihre tRNA posttrans-kriptional modifiziert wird. Ein Beispiel für diese Modifikationen ist die Insertion von Schwefel, wie sie durch die beiden Sulfurtransferasen ThiI und MnmA katalysiert wird. ThiI katalysiert die Insertion von Schwefel an Position 8 der tRNA. Hier wird Sauerstoff am C4-Atom des Uridins mit Hilfe des Enzyms IscS durch Schwefel substituiert. Das so entstandene 4Thiouridin kann in den meisten tRNAs aus Archaea und Bakterien gefunden werden und ist ein wichtiger Bestandteil eines in Escherichia coli und Salmonella enterica serovar typhimurium nachgewiesenen UV-Schutzmechanismusses. Zusätzlich konnte eine Beteiligung von ThiI an der Thiaminbiosynthese nachgewiesen werden. Die tRNA Modifikation durch MnmA erfolgt ebenfalls über IscS. Jedoch wird hier Sauerstoff am C2-Atom des Uridins an Position 34 der tRNA substituiert. Das so entstandene 2Thiouridin wird weiter zu Methylaminomethyl-2Thiouridin modifiziert, das in den tRNAs für Glutamin, Glutamat und Lysin in Archaea, Bakterien und Eukaryoten gefunden werden kann. Es unterdrückt das sog. Wobble-Problem.Die Struktur von ThiI und MnmA aus Escherichia coli und dem Hyperthermophilen Thermotoga maritima sollte aufgeklärt werden. Dazu wurden die entsprechenden Gene in Escherichia coli kloniert und exprimiert. Es war möglich, Aufreinigungs-protokolle für die verschiedenen Proteine zu etablieren. Bei den nachfolgenden Kristallisationsversuchen wurden jedoch keine zur Strukturaufklärung geeigneten Kristalle erhalten. Im Zuge der Arbeiten gelang es dann aber einen Komplex von ThiI aus Thermotoga maritima und einer verkürzten tRNA (39-mer tRNAPhe, einem Minimalsubstrat der Enzymkatalyse) zu generieren und zu kristallisieren. Die so erhaltenen Kristalle wurden zu röntgenkristallographischen Studien heranzogen.