Identifizierung und Charakterisierung von Genen und korrespondierenden Genprodukten aus Metagenombanken, die Butanol-Dehydrogenase-Aktivität oder proteolytische Aktivität vermitteln
Identification and characterization of genes and encoding gene products of metagenomic libraries conferring butanol dehydrogenase activity or proteolytic activity
by Tanja Waschkowitz
Date of Examination:2006-05-03
Date of issue:2006-07-07
Advisor:PD Dr. Rolf Daniel
Referee:PD Dr. Rolf Daniel
Referee:Prof. Dr. Wolfgang Liebl
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-645
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Format:PDF
Description:Dissertation
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Abstract
English
The cultivation-independent assessment and exploitation of the vast microbial diversity by metagenomics offers an almost unlimited resource of new genes, gene products, and biosynthetic pathways for biotechnological and other purposes. The metagenomic approach is based on direct isolation of DNA from environmental samples and on cloning of the recovered DNA into vectors. For retrieval of novel products, the constructed so-called metagenomic libraries are then sequence-based or activity-based screened for genes encoding stable biocatalysts and other microbial products of interest. In this study, complex metagenomic libraries from different environments were constructed and screened for genes conferring butanol dehydrogenase activity or proteolytic activity. Subsequently, the genes and gene products that were responsible for the targeted activities were identified and characterized.The screening of the metagenomic libraries for butanol dehydrogenase activity yielded two positive Escherichia coli clones. The recombinant plasmids recovered from these clones (pTWB3 and pTWB4) conferred a stable and NADPH-dependent butanol dehydrogenase activity. Further characterization of pTWB4 resulted in the identification of the gene that is responsible for the activity. The amino acid sequence deduced from the identified gene showed no homology to known alcohol dehydrogenases or oxidoreductases but revealed significant similarities to an oligoendopeptidase from Bacillus licheniformis.The screening of the constructed metagenomic libraries for genes encoding proteolytic activity yielded five positive E. coli clones of which two were studied further. The insert sequences of the plasmids that were recovered from these clones harbored each a gene coding for a protease (mprA and mprB). The deduced amino acid sequences of MprA and MprB showed significant similarities to a zinc-dependent metalloprotease of Pseudoalteromonas sp. str. A28. Further analysis revealed that both enzymes belong to family M4 of the zinc-dependent metalloproteases. Members of this family are formed as inactive precursors and are secreted. In addition, M4 metalloproteases contain N-terminal and in some cases C-terminal pro-peptides, which play an important role during maturation of the proteins. The gene products of mprA, mprB, and derivatives of these genes that contained deletions in the N-terminal or C-terminal regions were produced in E.coli BL21 and analyzed. The experiments revealed that the N-terminal region is essential for proteolytic activity of the enzyme whereas deletions of the C-terminal regions had no significant effect on proteolytic activity. In addition, proteolytic activities of the enzymes were only detected after export into the culture supernatant. A biochemical characterization of the different active proteases was performed.
Keywords: Metagenomic; metagenomic DNA libraries; screening strategies; butanol dehydrogenases; proteases
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In den vergangenen Jahren wurde es durch kultivierungsunabhängige metagenomische Analysen ermöglicht, die natürlich vorkommende mikrobielle Diversität als nahezu unerschöpfliche Ressource für neuartige Biokatalysatoren und Wirkstoffe zu erschließen. Dazu wird die gesamte mikrobielle DNA aus einer Standortprobe isoliert und direkt kloniert. Die Hinterlegung der auf diesem Weg erhaltenen genetischen Informationen erfolgt in komplexen Genbanken, so genannten Metagenombanken. Diese können in heterologen Wirten beliebig oft vermehrt, mit sequenzabhängigen oder auf biologischer Aktivität basierenden Verfahren analysiert und sowohl für die Anwendung als auch für die Forschung genutzt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Metagenombanken konstruiert und aktivitätsbasierend auf Gene durchmustert, die Butanol-Dehydrogenase-Aktivität oder proteolytische Aktivität vermitteln. Die für die entsprechenden Aktivitäten verantwortlichen Gene wurden anschließend identifiziert und charakterisiert.Im Rahmen des Butanol-Dehydrogenase-Screenings konnten zwei positive Escherichia coli-Klone identifiziert werden, deren rekombinanten Plasmide (pTWB3 bzw. pTWB4) in der Lage waren, eine stabile NADPH-abhägige Butanol-Dehydrogenase-Aktivität zu vermitteln. Durch weitere Untersuchungen konnte bei pTWB4 das für die Aktivität verantwortliche Gen identifiziert werden. Die abgeleitete Aminosäuresequenz des Genprodukts zeigte keinerlei Ähnlichkeiten zu Proteinsequenzen von bekannten Alkohol-Dehydrogenasen oder Oxidoreduktasen, sondern wies große Übereinstimmungen zu der Proteinsequenz einer Oligoendopeptidase aus Bacillus licheniformis auf.Im Rahmen des Screenings nach proteolytischer Aktivität konnten fünf positive E. coli Klone identifiziert werden, von denen zwei näher charakterisiert wurden. Auf den Insertsequenzen der aus diesen Stämmen isolierten rekombinanten Plasmide, konnte jeweils ein Protease-Gen (mprA und mprB) identifiziert werden. Die Aminosäuresequenzen der beiden abgeleiteten Genprodukte zeigten Ähnlichkeiten zu einer Zink-abhängigen Metalloprotease aus Pseudoalteromonas sp. str. A28. Durch weitere Sequenzanalysen konnten MprA und MprB in die Familie M4 der Zink-abhängigen Metalloproteasen eingestuft werden. Proteasen dieser Familie zeichnen sich dadurch aus, dass es sich um sekretierte Enzyme handelt, welche als inaktive Vorläufer Proteine gebildet werden. Sie besitzen N-terminale und teilweise auch C-terminale Prosequenzen, denen unterschiedliche Funktionen bei der Reifung der Proteasen zugesprochen wird. Die Gene mprA und mprB sowie unterschiedliche Derivate mit Deletionen im N-terminalen bzw. C-terminalen Genbereichen wurden in E. coli BL21-Zellen produziert. Es konnte gezeigt werden, dass der N-terminale Genbereich im Gegensatz zum C-terminalen Genbereich essentiell für die proteolytische Aktivität der Proteasen ist. Ferner zeigten nur in den Kulturüberstand exportierte Enzyme Aktivität. Weiterhin erfolgte eine biochemische Charakterisierung der aktiven Proteasen und ihrer aktiven Derivate.
Schlagwörter: Metagenomik; Umweltgenbanken; Screening-Strategien; Butanol-Dehydrogenasen; Proteasen
