Localization and dimerization of the ABC half transporter rAbcb6 as compared to rAbcb7

Abstract

Abcb6 (rAbcb6) ist ein ABC-Halbtransporter der ABCB-Subfamilie und benötigt einen Dimerisationspartner, um seine Funktion ausüben zu können. Das Hauptziel dieser Arbeit war die Identifizierung eines Dimerisationspartners für rAbcb6. Aufgrund der Sequenzhomologie zwischen menschlichem ABCB7 und ABCB6 kam Ratten-Abcb7 als putativer Dimerisationspartner für rAbcb6 in Betracht. Während des Klonens der rAbcb6 cDNA Sequenz wurden - abgesehen von der Wildtyp-Sequenz - immer wieder cDNAs gefunden, die im Vergleich zu der Referenzsequenz insgesamt 14 einzelne Nukleotidänderungen aufwiesen. Zum ersten Mal wurde die gesamte Länge der als rAbcb7 cDNA kodierenden Sequenz geklont und in der EMBL Datenbank unter der Zugangsnummer AJ621255 abgelegt. Der Vergleich der rAbcb6- und rAbcb7-mRNA-Expression zeigte, dass rAbcb7 am stärksten im Herz exprimiert wurde, rAbcb6 dagegen am höchsten im Testis, obwohl beide ubiquitär in den Organen der Ratte angezeigt waren. Die von rAbcb6 und rAbcb7 cDNR abgeleiteten Proteine zeigten 41% Übereinstimmung der Aminosäuresequenz. Expressionsvektoren, die für rAbcb6-EGFP, rAbcb6-V5, rAbcb6-DsRed2, rAbcb7-EGFP, rAbcb7-V5 und rAbcb7-DsRed2 Fusionsproteine kodieren, wurden kloniert und bei der transienten Transfektion von Säugetierzellen verwendet.In transienten kotransfizierten menschlichen LoVo-Zellen wurde keine signifikante Kolokalisierung zwischen grün fluoreszierendem rAbcb6-EGFP und rot fluoreszierendem rAbcb7-DsRed2 festgestellt. Außerdem brachte das rAbcb6-Protein ein punktförmiges Muster hervor, das rAbcb7-Protein dagegen ein wurmförmiges Expressionsmuster. Weitere Experimente haben gezeigt, dass das Verteilungsmuster von V5-, EGFP- order DsRed2-getagtem rAbcb6 und rAbcb7 tag-unabhängig war. LoVo- und Maus-TM3-Zellen wurden mit einem rAbcb6-EGFP-Protein kodierenden Vektor und einem Organellmarkerprotein kodierenden Vektor (DsRed getagter mitochondrialer Marker order lysosomaler/spät endosomaler Marker Lamp1-DsRed) transient kotransfiziert. Nahezu keine Kolokalisierung wurde zwischen rAbcb6-EGFP und dem mitochondrialen Markerprotein beobachtet, aber in beide Zelllinien zeigte das Verteilungsmuster von rAbcb6-EGFP zeigten eine beträchtliche Überlappung mit Lamp1-DsRed. rAbcb7-EGFP kolokalisierte mit mitochondrialen Marker in LoVo- und HEK293-Zellen, die beide Fusionsproteine exprimierten.Die Western-Blot-Analyse von fraktionierten Zellhomogenaten, die getagtes rAbcb7 oder getagtes rAbcb6 beinhalteten, zeigte, dass rAbcb7-V5 (mit elektrophoretischer Mobilität entsprechend 70 kDa) in einer Fraktion, die bei 10,000 x g sedimentiert wurde, angereichert war, während der Großteil von rAbcb6-V5 (80 105 kDa) oder rAbcb6-EGFP (110 130 kDa) in der Fraktion gefunden wurde, die bei 18,000 x g sedimentiert war. rAbcb6-EGFP- und rAbcb6-V5-Fusionsproteine wurden aus den Extrakten von transient kotransfizierten TM3-, LoVo- und HEK293-Zellen koimmunopräzipitiert, ebenso rAbcb7-EGFP und rAbcb7-V5 als Koimmunopräzipitat in LoVo- und HEK293-Zellen, was darauf hinweist, dass rAbcb6 und rAbcb7 Homodimere bilden. Keine Anzeichen gab es hingegen für eine Koimmunopräzipitation von rAbcb6- mit rAbcb7-Fusionsproteinen, was darauf hindeutet, dass eine Heterodimerisation von diesen beiden Proteinen unwahrscheinlich ist.