Interference of Toxoplasma gondii with IFN-γ-regulated gene expression of its host cell
Beeinflussung der IFN-γ-regulierten Genexpression durch Toxoplasma gondii in seiner Wirtszelle
by Christine Lang
Date of Examination:2005-05-04
Date of issue:2005-07-11
Advisor:Prof. Dr. Uwe Groß
Referee:Prof. Dr. Wolfgang Engel
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that is able to persist within its host for the host s life span. The parasite has evolved multiple strategies in order to establish and maintain this persistence. One such strategy is the inhibition of IFN-γ-induced MHC class II expression via interference with IFN-γ-mediated signalling. In this study, it could be shown that viable T. gondii inhibit IFN-γ-induced MHC class II expression in the monocyte/macrophage cell line RAW 264.7. More importantly, analysis of the effect of T. gondii on a number of other IFN-γ-responsive genes revealed that the parasite interferes with mRNA levels of most but not all of the genes analysed so far. Parasite requirements for inhibition of IFN-γ-induced MHC class II up-regulation were analysed and the mechanisms involved on the host cell level were then further elucidated. It is shown that invasion of the host cell but not intracellular replication is required to enable the parasite to interfere with IFN-γ-induced MHC class II expression in murine macrophages. Furthermore, a T. gondii lysate was found to mimic the effect of viable parasites on MHC class II expression, suggesting that a parasite-derived factor rather than the process of host cell invasion itself is involved. However, analyses of the underlying cell-biological mechanisms revealed that viable parasites and T. gondii lysate differentially interfere with IFN-γ-mediated MHC class II expression. Thus, T. gondii exert diverse effects on those processes leading to MHC class II expression. The molecule within the parasite lysate mediating the inhibition of MHC class II is partially sensitive to pronase treatment indicating the involvement of a protein. Furthermore, it appears to be released by extracellular parasites, since T. gondii separated from the host cells by a semipermeable membrane also inhibit MHC class II expression of non-infected macrophages. However, different preparations of T. gondii-derived excretory/secretory (ES) antigens from the three specific ES organelles of the parasite did not interfere with IFN-γ-regulated MHC class II expression. Analyses of the mechanisms of the T. gondii-mediated abrogation of MHC class II expression on the host cell level revealed that viable parasite and the parasite lysate differentially interfere with the IFN-γ-induced signalling. Viable T. gondii and the parasite lysate do not abrogate the IFN-γ-induced nuclear translocation of Stat1γ, but both interfere with the expression of the class II transactivator (CIITA). However, only viable parasites inhibit the transcript levels of interferon regulatory factor 1 (IRF-1). In addition, both parasite lysate and viable T. gondii abrogate the IFN-γ-induced transcriptional activity of the CIITA promoter IV while only viable T. gondii are also able to interfere with a minimal GAS-containing promoter as determined by luciferase reporter assays. This suggests the importance of the GAS-sequence and Stat1γ for interference of viable parasites with the transcriptional activation of IFN-γ-responsive genes. Furthermore, DNA-binding studies by EMSA revealed, that T. gondii lysate does not alter the DNA-binding activity of Stat1γ to the GAS-sequence. In contrast, viable parasites clearly diminish the formation of the IFN-γ-induced GAS-Stat1γ-Stat1γ complex but instead induce the formation of a modified GAS-binding complex of lower electromobility, which was found to contain Stat1γ. Precipitation with oligonucleotides containing the GAS-sequence, 2D-gelelectrophoresis and MALDI-Tof analyses revealed, that T. gondii interferes with the association of γ-actin to GAS-containing DNA, which is independent of stimulation with IFN-γ and of Stat1γ-binding to GAS. Furthermore, viable parasites abrogate the acetylation of histone 4 on the CIITA promoter IV, further indicating that T. gondii interferes with the assembly of the basal transcription machinery. In conclusion, T. gondii alter the IFN-γ-induced chromatin remodelling at the CIITA promoter IV and diminish the recruitment of γ-actin to the basal tra nscriptional machinery. This may then abrogate IFN-γ-induced expression of MHC class II genes and possibly other IFN-γ-triggered immune responses facilitating intracellular survival of the parasite and its ability to establish persistent infections.
Keywords: Toxoplasma gondii; IFN-gamma; MHC class II; Stat1; GAS; CIITA promoter IV; histone H4; beta-actin
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Der obligat intrazelluläre Parasit Toxoplasma gondii ist dazu fähig in seinem Wirt eine lebenslange persistierende Infektion zu etablieren. Diese Persistenz wird durch eine ganze Reihe von Immunevasions-Strategien des Parasiten erreicht. Eine solche Strategie ist die Parasiten-vermittelte Inhibierung der IFN-γ-induzierten MHC Klasse II Expression. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß lebende T. gondii die IFN-γ-induzierte MHC Klasse II Expression in der Monocyten/Makrophagen Zellinie RAW 264.7 inhibieren. Weitergehend zeigte sich, daß T. gondii dazu fähig ist, die mRNA Level von den meisten, aber nicht von allen hier untersuchten IFN-γ-regulierten Genen zu beeinflussen. Die Analyse der Vorraussetzungen, die der Parasit erfüllen muß, um die IFN-γ-induzierten MHC Klasse II Expression in murinen Macrophagen zu inhibieren, zeigten, daß die Invasion der Wirtszelle, nicht aber die intrazelluläre Vermehrung des Parasiten eine wichtige Rolle spielt. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß ein T. gondii Lysat den Effect von lebende Parasiten auf die IFN-γ-induzierte Hochregulierung der MHC Klasse II Expression nachahmen konnte. Allerdings hat die Analyse der hier involvierten zellbiologischen Mechanismen ergeben, daß lebende Parasiten und T. gondii Lysat auf unterschiedliche Weise in die IFN-γ-induzierte Signaltransduktion eingreifen. Das Molekül des Parasitenlysats, das an der Inhibierung der MHC Klasse II Expression beteiligt zu sein scheint, ist teilweise sensitiv gegen Behandlung mit Pronase, was auf die Involvierung eines Proteins hinweist. Experimente mit Parasiten, die von ihren Wirtszellen durch eine semipermeable Membran getrennt inkubiert wurden und die trotzdem die IFN-γ-induzierten MHC Klasse II Expression der nicht-infizierten Makrophagen inhibieren konnten, deuten darauf hin, daß sekretierte Faktoren des Parasiten eine Rolle spielen könnten. Allerdings haben verschiedene Päparationen von exkretorischen/sekretorischen (ES) Antigenen aus den drei spezifischen ES Organellen des Parasiten keinen inhibieren den Effekt auf die IFN-γ-induzierte Expression in nicht-infizierten Zellen gezeigt. Analysen der Mechanismen der T. gondii vermittelten Erniedrigung der MHC Klasse II Expression auf dem Level der Wirtszelle ergaben, daß lebende T. gondii und das Parasitenlysat auf unterschiedliche Weise eingreifen. Lebende Parasiten und T. gondii Lysat vermindern nicht die IFN-γ-induzierte nukleäre Translokation des signal transducer and activator of transcription (Stat) 1γ, aber in beiden Fällen ist die Expression des class II transactivator (CIITA) geringer als in nicht infizierten bzw. nicht Parasitenlysat behandelten Kontrollzellen. Bezeichnenderweise beeinflussen nur lebende Parasiten die Expression des interferon regulatory factor-1 (IRF-1). Des weiteren verringern beide, lebende T. gondii und Parasitenlysat, die transkriptionelle Aktivität des CIITA Promotor IV, während nur lebende T. gondii dazu fähig sind einen minimalen GAS enthaltenden Promotor zu beeinflussen, wie durch Luciferase Reporter Assays gezeigt werden konnte. Diese Ergebnisse deuten auf die Wichtigkeit der GAS-Sequenz und Stat1γ für die Beeinflussung der Aktivität von IFN-γ-regulierten Genen durch lebende T. gondii hin. Außerdem konnten Analysen der DNA-Bindungsaktivität von Stat1γ an die GAS-Sequenz zeigen, daß diese durch das Parasitenlysat nicht verändert wird. Im Gegensatz dazu verringern lebende Parasiten deutlich die Formierung des IFN-γ-induzierten GAS-Stat1γ-Stat1γ Komplexes, und induzieren statt dessen die Bildung eines zusätzlichen modifizierten GAS-enthaltenden Komplexes mit einer geringeren Elektromobilität, welcher nachweislich auch Stat1γ enthält. Präzipitation mit Oligonucleotiden, die die GAS-Sequenz enthalten gefolgt von 2D-Gelelektrophorese und MALDI-Tof Analysen konnten zeigen, daß T. gondii die Bindung von γ-Aktin an GAS-enthaltende DNA hemmt. Dieser Effekt findet unabhängig von Stimulierung mit IFN-γ und somit von der Bindung von Stat1γ an GAS statt. Des Weiteren konnte gezeigt werden, daß T. gondii die IFN-γ-induzierte Acetylierung des Histones H4 am CIITA Promotor IV inhibiert. Dieses Ergebnis weist darauf hin, daß T. gondii die Bildung des transkriptionellen Initiationskomplexes verhindert und somit die Transkription der betroffenen Gene inhibiert. T. gondii scheint also dazu fähig zu sein, die IFN-γ-induzierten Veränderungen die zur Initiation der Transkription am CIITA Promotor IV führen, zu inhibieren. Solche Mechanismen könnten dann nicht nur eine Rolle in der Inhibierung der IFN-γ-induzierten Expression von MHC Klasse II spielen, sondern eventuell auch andere IFN-γ-stimulierte Gene betreffen, welches wiederum zum intrazellulären Überleben und der Persistenz des Parasiten beitragen könnte.
Schlagwörter: Toxoplasma gondii; IFN-gamma; MHC Klasse II; Stat1; GAS; CIITA Promotor IV; Histon H4; beta-Aktin