Investigation of Protein-protein Interactions within the Human Spliceosomal U4/U6.U5 tri-snRNP Particle

Abstract

Daten aus two-hybrid-Versuchen erlaubten es mir, Regionen zu definieren, über die die Proteine 220K, 200K und 116K miteinander interagieren. Diese Regionen beinhalten die N-terminale und C-terminale Region des 220K Proteins, die zweite Helikase-Domäne des 200K und die C-terminale Domäne des 116K Proteins. Interessanterweise wurden die meisten dieser Bindungsdomänen für die Interaktionen zwischen den Hefe-Orthologen Prp8p, Brr2p und Snu114p identifiziert.Das 102K Protein interagiert mit mehreren Partikel-spezifischen Proteinen des U5, wie auch des U4/U6 snRNPs. Es kann daher als potentiell brückenbildendes oder vernetzendes Protein bei der Formation oder der strukturellen Stabilisierung des tri-snRNPs gesehen werden. Die stabile Integration des 102K Proteins in das U5 snRNP wird über Interaktionen mit dem U5-220K, 200K und dem 116K Protein vermittelt. In dieser Arbeit wurde das U5-spezifische 102K Protein als einziges Protein identifiziert, welches mit den U4/U6-spezifischen Proteinen 61K und 90K interagiert. Es konnte gezeigt werde, daß die Interaktion zwischen 102K und 61K wichtig für die Formierung des tri-snRNPs ist. Das Krankheitsbild der Retinitis pigmentosa entsteht durch eine missense-Mutationen (A194E) im 61K Protein. In dieser Studie zeigte das mutierte Protein 61K eine schlechtere Bindung zum 102K. Die möglichen Mechanismen werden diskutiert. Mutationsanalysen zeigten, daß die TPR-Wiederholungen im 102K Protein jeweils spezifischen Interaktionspartnern zugeschrieben werden können. Alle TPR-Wiederholungen partizipieren in der Interaktion mit dem U4/U6-61K, wohingegen nur die ersten neun Wiederholungen mit dem 110K Protein, dem 200-4 Fragment des 200K und dem 220-1 Fragment des 220K Proteins interagieren.Das U4/U6-90K Protein interagiert innerhalb des 20K 60K 90K-Heterotrimers mit dem 60K Protein und kontaktiert die Stamm-II-Region der U6 snRNA im U4/U6-snRNP. In dieser Studie wurde gezeigt, daß das 90K Protein mit dem humanen recycling factor U6-p110 interagiert und daher eine Funktion im Recycling des U4/U6 snRNPs vermuten läßt. Mutationsanalysen haben gezeigt, daß der C-Terminus des 90K Proteins (Aminosäuren 417-683) verantwortlich für die Bindung zum U6-p110 ist. Während der Formierung des tri-snRNPs interagiert das U5-102K Protein ebenfalls mit dem C-Terminus des 90K Proteins, was vermuten läßt, daß das U5-102K Protein eine Rolle bei der Freisetzung des U6-p110 spielt. Weiter interagiert das 90K Protein über die N-terminale Region mit dem U2 snRNP-assoziierten Protein SPF30/SMNrp und könnte daher bei der Rekrutierung des tri-snRNPs in das Präspleißosom wichtig sein.Das tri-snRNP-spezifische Protein 110K interagiert mit dem U4/U6-90K, dem U5-102K und dem U5-200K Protein über seine C-terminale Region (ohne RS-Domäne). Da die Abwesenheit des 110K Proteins keinen Einfluß auf die Stabilität des tri-snRNPs hat, scheint eher die genaue Positionierung des 110K für die Unterstützung der Bindung des tri-snRNPs mit dem Präspleißosom wichtig zu sein.Das U5-52K Protein interagiert mit dem U5-102K und dem 15K Protein, wobei diese Interaktionen vermutlich die Integration des U5-52K in das U5 snRNP unterstützen. Bindungsstudien, die mit Deletionsmutanten des 52K Proteins durchgeführt wurden, zeigten, daß die N-terminalen zwei Drittel des 52K Proteins mit dem 102K interagieren und die C-terminale GYF-Domäne das 15K Protein bindet. Die GYF-Domäne wurde kürzlich als Polyprolin-bindendes Molekül beschrieben. Da das 15K Protein keine Prolin-reiche Sequenz aufweist, zeigen diese Daten zum ersten Mal, daß eine GYF-Domäne auch in einer Polyprolin-unabhängigen Weise an spezifischen Protein-Protein-Interaktionen beteiligt sein kann. Die kristallographischen Studien der GYF-Domäne des 52K Proteins im Komplex mit dem 15K Protein, die in einer kooperativen Arbeit mit dem Labor von Prof. Dr. Ralf Ficner an der Universität Göttingen gemacht wurden, zeigten, daß das 15K Protein Kontakte mit einem anderen Bereich der GYF-Domäne eingeht, als dies bei Prolin-reichen Molekülen der Fall ist. Daten aus dieser Studie und anderen zeigen, daß das 52K Protein als einziges, U5-spezifisches Protein nicht in das tri-snRNP integriert wird.Auf der Basis der Daten dieser Arbeit schlage ich ein Model für die Assemblierung des U4/U6.U5 tri-snRNPs vor.