Recycling der Sauren Lysosomalen Phosphatase: Eingrenzung der Recycling-vermittelnden Aminosäuresequenz und Untersuchungen möglicher Sortierungsfaktoren, die zur Umsetzung des Recyclings benötigt werden

Abstract

Die Lysosomale Saure Phosphatase (LAP) und Lamp1 sind lysosomale Membranproteine, die ein tyrosinhaltiges Sortierungsmotiv in ihrer 19 bzw. 11 Aminosäuren langen zytoplasmatischen Domäne enthalten. die zytoplasmatische Domäne des lysosomalen Membranproteins Limp2 trägt ein leucinhaltiges Sortierungsmotiv und erstreckt sich über 19 Aminosäuren. Neusynthetisierte LAP wird nach dem Austritt aus dem TGN zunächst zur Plasmamembran transportiert wird, wo sie in Folge einer schnellen Endozytose in die Endosomen gelangt. Aus den frühen Endosomen wird die LAP nicht sofort in die weitere lysosomale Transportrichtung dirigiert, sondern rezirkuliert zur Plasmamembran. Zwischen der endosomalen und der plasmamembranständgen LAP-Fraktion herrscht ein dynamsiches Gleichgewicht, da ein permanenter Austausch zwischen endosomaler und plasmamembranständiger LAP stattfindet. Der weitere Transport der LAP in die Lysosomen verläuft langsam. Nach einem 5-6-stündigen Chase sind 50% der markierten LAP! aus dem Recycling-Pool abgezogen und in die Lyosomen weitertransportiert worden. Da die LAP in einem Recycling-Prozeß akkumuliert, bevor sie zu den Lysosomen transportiert wird, unterliegt sie einem indirekten lysosomalen Transport. Lamp1 und Limp2 gelangen nach dem Verlassen des TGN direkt in die Endosomen ohne vorher die Plasmamembran zu passieren. Lamp1 und Limp2 akkumulieren nicht in einem Recycling Prozeß. Sie werden aus den Endosomen direkt zu den Lysosomen transportiert. Um die Frage nach dem Recyclingmechanismus zu beantworten wurde im ersten Teil dieser Arbeit der Recycling-vermittelnde Sequenzbereich der LAP charakterisiert. Zu diesem Zweck wurden LAP-Chimäre eingesetzt, deren zytoplasmatische Domäne gegen die zytoplasmatische Domäne von Lamp1 oder Limp2 ausgetauscht wurde. Entsprechende Lamp1- und Limp2-Chimäre trugen die zytoplasmatische LAP-Domäne. Die Untersuchungen zum Transport dieser Chimären zeigen, daß die zytoplasmatische Domäne der LAP für die Vermittlung des Recyclings notwendig und ausreichend ist. Für eine Eingrenzung des Recycling-vermittelnden Sequenzbereiches der LAP wurde das Recyclingsverhalten weiterer Chimäre analysiert. Durch den Austausch des Tyrosinmotivs im LAP-Tail (YRHV) gegen das Lamp1-Tyrosinmotiv (YQTI) konnte gezeigt werden, daß das LAP-Tyrosinmotiv des LAP-Tails für die Vermittlung des Recyclings notwendig ist. Die Analyse des Recyclingverhaltens einer Lamp1-Mutante, in der das Lamp1-Tyrosinmotiv durch das Ty! rosinmotiv von LAP ausgetauscht wurde ergab, daß das LAP-Tyrosinmotiv nicht nur notwendig, sondern auch ausreichend für die Vermittlung des Recyclings ist. Die Ergebnisse des Recycling-Assays dieser Arbeit zeigen, daß die Endosomen über einen Sortierungsmechanismus verfügen, der zwischen dem Tyrosinmotiven von LAP und Lamp1 unterscheidet. Während das LAP-Tyrosinmotiv das Recycling vermittelt, ist das Tyrosinmotiv von Lamp1 für die Zurückhaltung in der Zelle verantwortlich. Folglich wurden im Rahmen dieser Arbeit zum ersten Mal endosomale Sortierungsmotive (YRHV und YQTI) lysosomaler Membranproteine identifiziert. Es konnte noch nicht geklärt werden, welche zellulären Sortierungskomponenten an der Umsetzung dieser endosomalen Sortierung beteiligt sind. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde überprüft, ob das Tyrosinmotiv des LAP- bzw. Lamp1-Tails ausreichend sein kann, um die Interaktion mit einer zellulären Sortierungskomponente zu bestimmen. Mit Hilfe der BIAcore-Technologie erfolgte in dieser Arbeit die Analyse der in vitro Interaktion zwischen dem synthetisierten LAP- und Lamp1-Tailpeptid mit dem AP 1 Komplex. Der verwendete AP 1-Komplex wurde aus Schweinehirn aufgereinigt. Während das Lamp1-Tailpeptid eine starke Bindung an den AP1-Komplex zeigt, interagiert das LAP Tailpeptid nicht mit dem AP 1-Komplex. Die Ergebnisse dieser Bindungsanalysen mit chimären Tailpeptiden zeigen, daß das Tyrosinmotiv von Lamp1 notwendig und ausreichend für eine starke Bindung an den AP 1-Komplex ist. Das Tyrosinmotiv der LAP kann keine Bindung mit dem AP 1-Komplex vermitteln. Die Analyse weiterer chimärer Tailpeptide zeigte, daß das Threonin (Position 2 distal zum Tyrosin) des Lamp1-Tyrosinmotives für in vitro Interaktion mit AP 1 notwendig und ausreichend ist. Folglich können minimale Sequenzbereiche innerhalb eines Tyrosinmotivs ausreichen, um über die Interaktion mit einem Sortierungsfaktor (in diesem Fall AP 1) zu bestimmen.